霍永旭 李 宇 劉雁軍 郭元彪 楊春蕾 趙 聰

(四川大學(xué)生命科學(xué)院，四川 成都 600031)

人骨誘導(dǎo)因子和綠色熒光蛋白基因共表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定及在HT-29細(xì)胞中的表達(dá)

霍永旭 李 宇1劉雁軍2郭元彪3楊春蕾 趙 聰1

(四川大學(xué)生命科學(xué)院，四川 成都 600031)

目的 構(gòu)建和鑒定人骨誘導(dǎo)因子基因(hOGN)和綠色熒光蛋白(GFP)共表達(dá)慢病毒載體，并檢測其在人大腸癌細(xì)胞株HT-29中的表達(dá)水平。方法 采用PCR方法克隆hOGN基因；將hOGN基因連接到帶有GFP的慢病毒表達(dá)載體pEZ-Lv201中構(gòu)建慢病毒載體；將構(gòu)建的慢病毒載體質(zhì)粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)與慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔風(fēng)enti-Pac HIV mix共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集慢病毒懸液；重組病毒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，定量PCR法檢測重組病毒滴度；將構(gòu)建的pEZ-hOGN感染HT-29細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察和Western印跡檢測感染后HT-29細(xì)胞中GFP表達(dá)情況和目的基因hOGN的表達(dá)情況。結(jié)果 基因測序分析證實(shí)克隆的hOGN基因與GenBank提供的序列完全一致；構(gòu)建的重組慢病毒載體經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實(shí)OGN正確插入pEZ-Lv201；定量PCR測定慢病毒滴度為0.1×109～1×109TU/ml。在HT-29細(xì)胞中重組病毒感染96 h后在熒光顯微鏡下可檢測到較強(qiáng)的綠色熒光蛋白表達(dá)，Western印跡檢測到在HT-29細(xì)胞中hOGN蛋白過表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建攜帶hOGN基因的重組慢病毒載體，在HT-29細(xì)胞中有效表達(dá)。

骨誘導(dǎo)因子；綠色熒光蛋白；慢病毒載體；HT-29細(xì)胞

人骨誘導(dǎo)因子(hOGN)基因是富亮氨酸低分子蛋白聚糖家族的成員，存在于結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，如參與胞外基質(zhì)的合成，膠原纖維形成的調(diào)控等〔1〕。哺乳動(dòng)物中OGN參與了動(dòng)脈損傷的修復(fù)與重構(gòu)，因此OGN表達(dá)的增高有助于血管的重建〔2〕。近年研究顯示OGN表達(dá)的改變與腫瘤的遷移、黏附、增殖有密切的相關(guān)性〔3〕，OGN可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌〔4〕，而MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織屏障〔5〕，引發(fā)大腸癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲惡化〔6〕。本研究將人全長OGN基因克隆到慢病毒質(zhì)粒pEZ-Lv201上，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pEZ-hOGN，并感染人大腸癌細(xì)胞株HT-29。該慢病毒表達(dá)載體的正確構(gòu)建，為建立hOGN與腫瘤相關(guān)的研究，探討hOGN與大腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制和基因治療等方面奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pEZ-Lv201(pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro)為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購買于北京全式金生物技術(shù)公司。人大腸癌細(xì)胞株HT-29、人胚腎細(xì)胞株293T和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299均購買于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要酶和試劑 慢病毒包裝質(zhì)粒試劑盒(復(fù)能基因)；Taq酶、RT試劑盒(Takara)；限制性內(nèi)切酶ApaI、EcoRI、T4 DNA ligase(NEB)；1 000 bp DNA ladder marker(天根公司)；dNTP(Promega)；Plasmid抽提Kit(Qiagen)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；胰酶(上?；瘜W(xué)試劑公司)；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；兔抗OGN一抗(Abcam)；兔抗小鼠eGFP一抗、小鼠抗β-actin，小鼠抗GAPDH一抗(proteintech)；羊抗兔IgG二抗、羊抗小鼠IgG二抗(中杉金橋)；引物合成及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 hOGN基因的克隆 依據(jù)Genbank的hOGN基因的編碼區(qū)(CDS)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，根據(jù)載體質(zhì)粒pEZ-Lv201的要求在引物中引入EcoRI和ApaI酶切位點(diǎn)。正義鏈：GGAATTACAAGGCTGTTAGAGAG；反義鏈：GGGGCCCTATTAATAACTAATGCATG(劃線部分為酶切位點(diǎn))，hOGN基因提取于人正常大腸組織，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、3 min，變性94℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與Genbank提供的條帶大小897 bp相符，膠回收產(chǎn)物保存待用。

1.3.2 重組慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定和純化 構(gòu)建和鑒定：慢病毒質(zhì)粒pEZ-Lv201和目的片段分別經(jīng)EcoRI和ApaI雙酶切消化，用T4 DNA連接酶連接，形成含GFP基因的克隆重組體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，擴(kuò)增培養(yǎng)后用EcoRI和ApaI雙酶切鑒定，并測序鑒定插入DNA片段的正確性。

1.3.3 重組慢病毒的包裝和滴度測定 ①包裝：重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pEZ-hOGN、慢病毒包裝質(zhì)粒復(fù)合體Lenti-Pac HIV mix與轉(zhuǎn)染試劑DNA-EndoFectin complex混合后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48 h后收集病毒上清，4℃下500 r/min離心10 min棄去細(xì)胞碎片，上清液用0.45 μm聚醚砜低蛋白質(zhì)鏈接過濾器過濾收集病毒顆粒，濃縮后分裝10 μl/EP管，-70℃保存。②滴度測定：24孔板接種H1299細(xì)胞2×105/孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞50%融合。慢病毒液分別以0.5、1、2、10、30 μl感染H1299細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞數(shù)以計(jì)算病毒滴度。為避免誤差，只選擇GFP陽性細(xì)胞率為1%～30%孔進(jìn)行計(jì)算，取各組平均值計(jì)算滴度。

1.3.4 轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞株HT-29及其表達(dá)情況鑒定 24孔板接種HT-29細(xì)胞1×105/孔，24 h后加入預(yù)先混好的MOI=10的重組慢病毒完全培養(yǎng)液2 ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育12 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后在熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，并用Western印跡檢測OGN表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro的構(gòu)建和鑒定 hOGN基因編碼區(qū)DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳中可見897 bp特異性條帶，與理論值一致(圖1A)。hOGN的PCR產(chǎn)物純化后與載體pEZ-lv201進(jìn)行酶切，連接，轉(zhuǎn)化后，得到數(shù)10個(gè)克隆，挑取4個(gè)單克隆搖菌，菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示4個(gè)克隆(克隆1，2，3，4)可擴(kuò)增出897 bp的目的片段(圖1B)。經(jīng)測序鑒定與Genbank提供的序列一致，未發(fā)生任何突變，重組載體pEZ-hOGN構(gòu)建成功。

A：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測hOGN基因(897 bp有陽性條帶)；B：菌落PCR鑒定克隆載體(1、2、3、4陽性克隆，5陰性克隆，PC陽性對照，NC陰性對照)圖1 hOGN基因與構(gòu)建的重組慢病毒載體的鑒定

2.2 重組慢病毒包裝與病毒滴度測定 慢病毒包裝試劑盒Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit包裝慢病毒載體pEZ-hOGN及其對照pEZ-eGFP后熒光顯微鏡下觀察(圖2A、2B)。包裝后的慢病毒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后(圖2C、2D、2E)，測定慢病毒滴度約為2.12×109拷貝/ml，空載對照慢病毒濃縮后的病毒滴度約為7.9×1010拷貝/ml。

A：重組慢病毒包裝后白光下的293T細(xì)胞；B：重組慢病毒包裝后熒光顯微鏡下的293T細(xì)胞；C(1、2)：0.1 μl慢病毒載體pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro感染H1299細(xì)胞；D(1、2)：1 μl慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299細(xì)胞；E(1、2)：10 μl 慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299細(xì)胞圖2 重組慢病毒包裝與慢病毒滴度檢測

2.3 重組慢病毒感染HT-29細(xì)胞 重組慢病毒pEZ-hOGN以MOI為10感染HT-29細(xì)胞，感染后72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，感染效率達(dá)90%以上(圖3)。

A：明場慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的HT-29細(xì)胞B：熒光顯下慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的HT-29細(xì)胞圖3 慢病毒pEZ-hOGN感染后的HT-29細(xì)胞(×200)

2.4 Western印跡檢測HT-29細(xì)胞中hOGN的表達(dá) 重組慢病毒感染HT-29細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞總蛋白，Western印跡檢測細(xì)胞中OGN的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在36 kD左右有一條特異性條帶，其大小和OGN預(yù)測條帶相符合，說明包裝產(chǎn)生的高滴度pEZ-hOGN重組慢病毒感染細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)OGN蛋白(圖4)。

OGN：pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染的HT-29細(xì)胞；對照組：pEZ-SV40-IRES-Puro感染的HT-29細(xì)胞圖4 Western印跡檢測病毒感染HT-29細(xì)胞后hOGN的表達(dá)

3 討 論

人骨誘導(dǎo)因子是一類較為保守的生物蛋白，含有6 個(gè)亮氨酸富集區(qū)域，該區(qū)域是細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 修復(fù)和RNA 加工處理的分子識別標(biāo)志〔7,8〕。OGN蛋白主要分布于心室、角膜、皮膚、小腸、骨等正常組織中，是血管外基質(zhì)成分之一，可以通過調(diào)節(jié)左心室肥厚度來應(yīng)對外在因素的影響〔9〕，調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原纖維的生成，在早期骨細(xì)胞中高表達(dá)刺激骨細(xì)胞的形成〔10〕，以及具在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化〔11〕的等方面有重要作用。

最近研究表明hOGN在腫瘤組織和細(xì)胞系中異常表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，目前已發(fā)現(xiàn)hOGN在肝癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌〔12～14〕等惡性腫瘤中表達(dá)異常。大腸癌是世界上常見的高危害消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居前列〔15〕。細(xì)胞胞外基質(zhì)環(huán)境的變化是大腸腫瘤發(fā)生的重要原因之一，而且我們前期研究也發(fā)現(xiàn)hOGN在大腸癌細(xì)胞中異常表達(dá)。因此，構(gòu)建hOGN在大腸腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)的模型可以為我們研究大腸腫瘤的發(fā)病機(jī)制和探索相關(guān)分子治療提供了有效的工具。

慢病毒載體是目前一種應(yīng)用較多的目的基因重組的重要工具，其具有容納外源性目的基因片段大，體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，免疫反應(yīng)小和安全性較好等優(yōu)點(diǎn)〔16〕。重組的慢病毒載體可以感染非分裂細(xì)胞、分裂細(xì)胞以及多種組織。此外，pEZ-Lv201慢病毒載體屬于“自殺”性慢病毒，不會利用宿主細(xì)胞形成新的病毒顆粒，病毒感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞，已成為當(dāng)前重組基因研究的最佳選擇。

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〔2015-10-02修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省科技廳資助項(xiàng)目(No.14ZC1219)；成都市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(No.2013089)；成都市科技廳資助項(xiàng)目(No.2014-HM01-00217-SF)

楊春蕾(1964-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究。 趙 聰(1962-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事胃腸道腫瘤研究。

霍永旭(1988-)，男，碩士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

R34

A

1005-9202(2017)06-1332-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.012

1 成都市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科 2 成都市第三人民醫(yī)院普外科

3 成都市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究部