杜 斌 楊志勇 蔡維維 馮 磊 邱麗穎

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

α-硫辛酸對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用

杜 斌 楊志勇1蔡維維 馮 磊 邱麗穎

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

目的 研究α-硫辛酸(LA)對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 75只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組(水飛薊素)和LA低、高劑量組。自造模之日起，除正常組外，其余各組以2.5 ml/kg腹腔注射20%CCl4，每周2次，連續(xù)6 w。自造模之日起，LA低、高劑量組分別給予(100，300 mg·kg-1·d-1)灌胃，正常組和模型組小鼠給予1.0 g·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃，陽性對(duì)照組給予水飛薊素(200 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)給藥42 d。末次給藥2 h后乙醚麻醉，從眼內(nèi)眥靜脈取血，摘取肝臟，比較各組小鼠肝功能指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)特征的差異。結(jié)果 LA低、高劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性明顯低于模型組(P<0.01)；肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性較模型組明顯升高(P<0.01)；丙二醛(MDA)含量顯著下降(P<0.01)；通過Masson、HE染色光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，觀察到LA低、高劑量組可使炎細(xì)胞浸潤程度、肝細(xì)胞水腫程度及肝臟纖維化程度較模型組有所減輕。結(jié)論 LA可明顯減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化及肝臟炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抗氧化損傷有關(guān)。

α-硫辛酸；肝纖維化；四氯化碳

α-硫辛酸(LA)是一種萬能抗氧化劑。有研究表明抗氧化作用可在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞質(zhì)和脂蛋白中得到發(fā)揮，可清除體內(nèi)螯合金屬離子、自由基等〔1〕，可促進(jìn)機(jī)體能量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞自我修復(fù)，緩解炎癥〔2〕。本實(shí)驗(yàn)利用腹腔注射四氯化碳(CCl4)的方法進(jìn)行造模，建立小鼠肝纖維化動(dòng)物模型，并灌胃不同劑量的LA，通過觀察小鼠體重、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，肝組織中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平，并觀察肝臟病理組織學(xué)變化，以檢測(cè)LA的保肝作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料、藥品與試劑 ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，合格證書號(hào)：2007000564424。標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。適應(yīng)飼料后開始實(shí)驗(yàn)。LA(Sigma公司，批號(hào)12705243)；水飛薊素(Sigma公司，批號(hào)BCBF9631V)；AST(批號(hào)20131226)、ALT(批號(hào)20131225)、SOD(批號(hào)20131025)、MDA(批號(hào)20131024)、考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒(批號(hào)20140326)，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。TG16A-WS臺(tái)式離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；TS-8型漩渦混勻器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；DK-8B型電熱恒溫水浴槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；5804R多功能臺(tái)式離心機(jī)(德國艾本德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作方法 ICR小鼠75只，隨機(jī)分為5組，每組15只：即正常組，模型組，LA低、高劑量組，陽性對(duì)照組(水飛薊素組)。自造模之日起，除正常組外，其余各組以2.5 ml/kg腹腔注射20%CCl4〔3〕，每周2次，連續(xù)6 w。自造模之日起，除正常組、模型組外，LA低、高劑量組分別給予LA100，300 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組小鼠給予1.0 g·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃，陽性對(duì)照組給予水飛薊素200 mg·kg-1·d-1灌胃〔4〕，連續(xù)給藥42 d。末次給藥2 h后乙醚麻醉，從眼內(nèi)眥靜脈取血并離心出血清。在肝右葉位置切取小塊肝組織，置入10%中性甲醛緩沖液固定。其余肝組織分裝于離心管中-80℃冰箱保存。

1.3 小鼠體重 給藥第1天稱重并記錄，給藥第42天稱重并記錄。1.4 肝臟組織學(xué)觀察 另取肝右葉相同部位放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)HE染色，Masson染色光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 血清中AST、ALT活性的測(cè)定 眼眶取血，37℃水浴1 h，3 000 r/min離心15 min，取血清用于測(cè)定AST、ALT活性，各指標(biāo)測(cè)定按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 肝組織指標(biāo)的測(cè)定 取肝右葉相同部位的一小塊肝組織，用冰鹽水漂洗，剔除脂肪及結(jié)締組織，吸水紙吸干，稱重，然后放入10 ml離心管中；加入適量的冷生理鹽水，2 000 r/min勻漿10 s，間歇30 s，反復(fù)3次制成10%的組織勻漿；使用冷凍離心機(jī)，4℃，3500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定肝組織中SOD、MDA的活性。各指標(biāo)測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)小鼠體重的影響 給藥后第1天體重與給藥后第42天體重相比，正常組小鼠體重升高，模型組小鼠體重下降，水飛薊素組、LA高劑量組小鼠體重升高(P<0.01，P<0.05)，LA低劑量組小鼠體重?zé)o明顯變化(P<0.05),見表1。

2.2 組織病理學(xué)檢查 (1)HE染色：正常組肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝竇及匯管區(qū)無異常，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無炎性細(xì)胞。模型組肝索排列異常，肝細(xì)胞呈氣球樣變性腫脹，胞質(zhì)疏松，染色較淡。LA低劑量組、高劑量組、水飛薊素組較模型組肝竇明顯，肝細(xì)胞的胞質(zhì)均勻，氣球樣變性逐漸顯著減少。LA對(duì)CCl4所致急性肝損傷的病理改變有恢復(fù)作用，可減輕炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞濁腫，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，表明LA對(duì)CCl4所致肝纖維化小鼠具有一定的保護(hù)作用。見圖1。(2)Masson染色：正常組小鼠肝組織正常，肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，未見膠原纖維增生。模型組小鼠肝組織與正常組比較，膠原纖維明顯增多，形成膠原沉積且向門管區(qū)延伸明顯，互相連結(jié)，未見假小葉形成，但肝組織的正常結(jié)構(gòu)破壞顯著。LA低劑量組、高劑量組、水飛薊素組與模型組比較，肝膠原纖維減少明顯，表明LA對(duì)CCl4所致肝纖維化小鼠具有一定的保護(hù)作用。見圖2。

組別給藥后第1天給藥后第42天正常組25.9±0.743.1±1.62)模型組25.7±0.822.4±2.12)LA低劑量組24.4±0.734.4±1.0LA高劑量組23.4±2.034.2±2.71)水飛薊素組24.7±1.235.3±1.32)

與給藥后第1天比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖1 肝組織HE染色(×100)

圖2 肝組織Masson染色(×100)

2.3 對(duì)血清AST、ALT活性的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清AST、ALT的活性均升高(P<0.01)，說明肝功能有損傷。與模型組相比，LA低劑量組、高劑量組、水飛薊素組小鼠血清AST、ALT的活性均降低(P<0.01)。見表2。

2.4 對(duì)肝組織SOD、MDA含量的影響 與正常組相比，模型組小鼠肝組織中SOD含量降低，MDA含量升高(P<0.01)，說明模型比較成功。與模型組相比，LA低劑量組、高劑量組、水飛薊素組小鼠肝組織中SOD含量升高，MDA含量降低(P<0.01)。見表3。

組別ASTALT正常組41.3±1.750.3±2.2模型組88.6±2.81)108.2±2.51)LA低劑量組60.1±2.22)63.4±2.62)LA高劑量組47.8±2.02)54.4±4.22)水飛薊素組44.4±2.42)50.6±3.42)

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

組別SODMDA正常組28.1±0.90.60±0.05模型組22.4±0.51)0.88±0.061)LA低劑量組24.8±0.82)0.70±0.052)LA高劑量組25.5±0.72)0.65±0.042)水飛薊素組26.7±1.12)0.62±0.042)

3 討 論

肝纖維化是肝臟對(duì)細(xì)胞膜破壞、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、壞死組織機(jī)化再生等反復(fù)損傷修復(fù)的結(jié)果，是介于臨床上各種慢性肝炎與進(jìn)展至肝硬化的病理過程。CCl4是已知的經(jīng)典肝纖維化誘導(dǎo)劑，有關(guān)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的方法已很成熟，已廣泛用于保肝藥物的篩選、肝細(xì)胞損傷及機(jī)制及血清學(xué)標(biāo)志物的研究等。人肝損傷與誘導(dǎo)的動(dòng)物肝損傷模型較為相似。ALT、AST分別主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)及肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，是肝功能異常的敏感指標(biāo)。當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥時(shí)會(huì)引起 ALT、AST 的升高〔5〕。自由基參與肝纖維化等多種病理過程，了解自由基反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化與疾病的關(guān)系，可作為疾病的診斷、預(yù)后和抗氧化治療的一個(gè)有用指標(biāo)〔6～8〕。

本研究表明LA對(duì)炎細(xì)胞的浸潤、肝細(xì)胞的腫脹壞死都有明顯改善作用。α-LA干預(yù)可以有效降低肝組織MDA 濃度，提高SOD活性，對(duì)肝組織的氧化損傷具有保護(hù)作用〔9〕。α-LA干預(yù)組可降低肝損傷標(biāo)志性酶AST、ALT活性，表明α-LA可拮抗鎘致肝臟的損傷作用〔10〕。LA通過阻斷轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號(hào)通路抑制肝臟PAI-1表達(dá)和纖維化〔11〕。LA通過弱化血小板源生長因子(PDGF)和TGF-β激活性肝星狀細(xì)胞中的活性氧(ROS)-觸發(fā)性信號(hào)通路抑制肝纖維化〔12〕。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，LA在小鼠肝纖維化實(shí)驗(yàn)保護(hù)作用中存在量效關(guān)系，這種量效關(guān)系的存在，可能與肝纖維化損傷的程度有關(guān)。LA可能通過減輕肝脂質(zhì)過氧化損壞，致使膠原合成減少，纖維化程度減輕，保護(hù)了CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化。

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〔2015-04-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No.JUSRP51412B)

邱麗穎(1965-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥理學(xué)研究。

杜 斌(1983-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥理學(xué)研究。

R572.2

A

1005-9202(2017)06-1320-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.007

1 阜陽市人民醫(yī)院特需病房