劉 超 劉敬霞 黑常春 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

·基礎(chǔ)研究·

回醫(yī)扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腫瘤壞死因子-α和內(nèi)皮素-1表達的影響

劉 超 劉敬霞 黑常春 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

目的 探討扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF)-α和內(nèi)皮素(ET)-1表達的影響。方法 將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余各組均給予高脂喂養(yǎng)4 w后，再給予10%的自體糞便1 ml/100 g灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，造成痰熱腑實證模型；再采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)。大鼠給藥劑量為尼莫地平組10.8 mg/kg、扎里奴思方組1.54 g/0.1 kg，制備MCAO模型前3 d灌胃給藥。大鼠分別于缺血再灌注后1、3、7 d取腦；取材前進行腦組織含水量測定，采用免疫組化法檢測腦缺血側(cè)海馬區(qū)TNF-α、ET-1表達，RT-PCR檢測TNF-α mRNA和ET-1 mRNA的表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量增高(P<0.01)、TNF-α、ET-1陽性細胞和TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表達明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組腦組織含水量降低、TNF-α、ET-1陽性細胞數(shù)減少，TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表達降低(P<0.01)。與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低、TNF-α、ET-1陽性細胞數(shù)減少和TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表達降低(P<0.05)。結(jié)論 扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)元起保護作用，其機制可能與抑制大鼠腦內(nèi)TNF-α和ET-1的表達有關(guān)。

扎里奴思方；腦缺血再灌注；痰熱腑實證；腫瘤壞死因子(TNF)-α；內(nèi)皮素(ET)-1

缺血性腦血管疾病(ICVD)發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高等特點〔1〕。在該病的發(fā)生中炎癥反應(yīng)促進了腦缺血損傷的發(fā)展，是腦和神經(jīng)損傷的主要病理機制之一〔2〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是炎癥反應(yīng)的始動因子，在腦缺血再灌注早期，TNF-α的合成和釋放增加是促進腦梗死形成的重要原因〔3〕。內(nèi)皮素(ET)-1參與腦缺血、腦水腫的病理生理過程，可增加腦組織內(nèi)水、鈉含量，從而促進缺血性腦水腫的發(fā)生、發(fā)展〔4〕，引起血管強烈收縮導(dǎo)致神經(jīng)元缺血、壞死，并可促使炎性因子過度表達。《回回藥方》中扎里奴思方具有芳香開竅、補腎益髓、化痰祛瘀之功，對缺血再灌注大鼠具有調(diào)控血腦屏障、抗腦缺血損傷和保護神經(jīng)元等作用〔5〕。本研究擬探討扎里奴思方對腦缺血后神經(jīng)元的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，3～4月齡，體重(300±50)g，寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(寧)2014-0001。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，溫度(25±1)℃，濕度(50±10)%，自由覓食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2 藥物

1.2.1 扎里奴思方 組成：海狗腎(膃肭臍)12 g、肉桂(薩底知)12 g、菟絲子(阿夫忒蒙)12 g、石菖蒲(哈咱卜咱里刺)12 g、安息香(阿你松)3 g、小茴香(法理公)12 g、乳香(兀沙吉)12 g、當(dāng)歸(法忒刺撒里榮)12 g、沒藥(木里葉)12 g、懷牛膝(干祖伐)24 g、番紅花(撒法郎)12 g、蘆薈(拆不牙刺)12 g、牡丹皮12 g、水龍骨(伯思八牙)12 g。由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院提供制備。

1.2.2 尼莫地平片 規(guī)格30 mg/片，山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責(zé)任公司。將尼莫地平研磨成細小的粉末狀，加入適量的生理鹽水混勻(1.08 mg/ml)灌胃。

1.2.3 高脂飼料〔6〕3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.12%丙硫氧嘧啶、2%吐溫-80、10%豬油、84.38%基礎(chǔ)飼料。

1.3 主要試劑和儀器 蒸餾水(寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)；膽固醇(鄭州興昌化工產(chǎn)品有限公司，批號：57784)；1，2-丙二醇(重慶博洋生物技術(shù)有限公司，批號：57854)；吐溫-80(重慶博洋生物技術(shù)有限公司)；豬油(超市購買)；TaKaRa RNA PCR試劑盒(TaKaRa公司)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；局灶性腦缺血(MCAO)A4尼龍栓線(重慶博洋生物技術(shù)有限公司，批號：2832-A4)；多聚甲醛(重慶博洋生物技術(shù)有限公司)；兔二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑；電子天平(BT224S，Sartorius公司)。

1.4 分組與用藥 將60只雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組(痰熱腑實證腦缺血組)，尼莫地平組，扎里奴思方組，15只/組。除假手術(shù)組外，其他各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，再予自體糞便3 d后，每組隨機抽選3只大鼠，腹主動脈采血，檢測血脂，若血脂異常為痰熱腑實模型造模成功，然后模型MCAO制備〔7〕。假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃，藥物治療組分別用相應(yīng)藥物灌胃。大鼠灌胃用藥量根據(jù)生藥材含量按等效劑量換算關(guān)系計算，灌胃體積為1 ml/100 g，扎里奴思方為1.54 g/ml；尼莫地平1.08 g/L。大鼠術(shù)后每日用藥1次，均于術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.5 腦組織含水量測定 各組大鼠斷頭取左側(cè)缺血腦組織。首先用電子天平稱濕重，然后將腦組織放入恒溫烤箱內(nèi)烘干至恒重，稱取干重。根據(jù)Elliot公式來計算，腦含水量%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測TNF-α和ET-1表達 采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)染色法檢測TNF-α和ET-1在缺血海馬區(qū)的蛋白表達情況，按照試劑盒提供的實驗步驟操作：對各組大鼠按規(guī)定時間灌注后取腦，石蠟包埋脫水，3%H2O2室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶；微波爐加熱至沸騰，熱修復(fù)抗原；滴加封閉液，室溫30 min；滴加1∶100工作濃度的一抗，4℃過夜；滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min；滴加試劑SABC，37℃孵育30 min；DAB顯色；蒸餾水沖洗；復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。位于胞質(zhì)或胞核內(nèi)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性表達。陽性細胞計數(shù)：在400倍光學(xué)顯微鏡下每張切片采用盲法隨機選取5個視野，分別計數(shù)免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.7 RT-PCR法檢測腦組織TNF-α mRNA和ET-1 mRNA 提取腦組織總RNA。取細胞總RNA2 μl，加雙蒸水2 ml，于分光光度計260 nm和280 nm處測吸光度(A)，A260/A280在1.9～2.1范圍之間方可使用。選用β-actin基因作內(nèi)參照，按照2-△△Ct相對定量公式計算TNF-α mRNA和ET-1 mRNA的含量。各引物序列、產(chǎn)物長度：β-actin正義：5′-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3′，反義：5′-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3′，產(chǎn)物長度155 bp；TNF-α正義：5′-GATCGGTCCCAACAAGGAGG-3′，反義：5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，產(chǎn)物長度138 bp；ET-1正義：5′-TCCAAGAAAGGAAAACCC-3′，反義：5′-TGCAACACGAAAAGATGC-3′，產(chǎn)物長度126 bp。反應(yīng)條件：β-actin：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；TNF-α：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，70℃ 50 s，34個循環(huán)；ET-1：94℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 52 s，40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、最小顯著差法(LSD-t)及秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量 模型組與假手術(shù)組比較各時間點大鼠腦組織含水量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組大鼠各時間點腦組織含水量降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)；與1 d組比較，尼莫地平7 d組和扎里奴思方7 d組腦組織含水量均降低(P<0.05，P<0.01)；與3 d組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)TNF-α、ET-1的表達 模型組各時間點TNF-α、ET-1陽性細胞表達較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組TNF-α、ET-1陽性細胞表達顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組TNF-α、ET-1陽性細胞表達降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1，圖2，表2。

2.3 對腦缺血再灌注大鼠腦組織TNF-α、ET-1 mRNA表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組各時間點TNF-α、ET-1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組TNF-α、ET-1 mRNA表達顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組TNF-α、ET-1 mRNA 表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同組別不同時間點比較，尼莫地平7 d組TNF-α、ET-1 mRNA表達較1 d組降低(P<0.05)，扎里奴思方7d組TNF-α、ET-1 mRNA表達較1 d組降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

組別1d3d7d假手術(shù)組56.05±2.6256.05±2.6256.05±2.62模型組59.45±1.861)60.52±1.151)62.34±0.961)尼莫地平組57.68±1.032)58.72±1.022)57.84±0.7444)扎里奴思方組57.23±0.912)56.52±1.262)55.23±0.8143)5)6)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與尼莫地平組比較：3)P<0.05；與1 d組比較：4)P<0.05，5)P<0.01；與3 d組比較：6)P<0.05；下表同

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)TNF-α、ET-1陽性細胞變化(DAB，×400)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)ET-1陽性細胞變化(DAB，×400)

組別TNF-α陽性細胞1d3d7dET-1陽性細胞1d3d7d假手術(shù)組5.18±0.945.24±0.895.47±1.126.58±2.526.45±2.236.72±1.71模型組30.35±1.541)32.74±0.691)38.81±1.671)22.79±7.351)23.14±6.261)24.65±5.041)尼莫地平組23.35±1.032)24.57±0.682)23.94±0.532)17.64±3.912)18.50±4.822)16.52±3.902)扎里奴思方組23.52±0.932)24.06±0.802)22.88±0.632)3)16.89±6.562)17.23±2.602)15.37±3.522)3)

組別TNF-α1d3d7dET-11d3d7d假手術(shù)組0.93±0.600.96±0.650.94±0.240.66±0.060.64±0.050.60±0.02模型組2.21±0.131)2.24±0.251)2.16±0.261)2.47±0.081)2.35±0.051)2.52±0.031)尼莫地平組1.79±0.132)1.63±0.042)1.54±0.102)5)1.88±0.132)5)1.93±0.042)1.65±0.102)扎里奴思方組1.64±0.082)3)1.53±0.092)3)1.24±0.302)3)4)5)1.82±0.142)3)1.76±0.132)3)1.51±0.122)3)4)5)

3 討 論

回族醫(yī)學(xué)對腦病的防治有著特有的理論認識和豐富的治療經(jīng)驗〔8〕?！痘鼗厮幏健氛撛锱挤健翱砷_竅，凈其渾身厚濁風(fēng)痰，治療痰盛弱病”，具有芳香開竅、化痰祛瘀、補腎益髓之功，是回族醫(yī)學(xué)治療缺血性腦病的常用方劑之一〔9〕。腦缺血損傷可引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)，其中，炎癥反應(yīng)是造成缺血再灌注損傷的重要病理機制〔10〕。TNF-α表達增高可加快細胞凋亡〔11〕。TNF-α可上調(diào)血管內(nèi)皮細胞和白細胞上的黏附分子的表達，加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中性粒細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附作用，阻礙腦組織的供血，損傷局部血管，導(dǎo)致血管通透性增加，促使腦缺血和水腫的發(fā)生，加重缺血性腦組織的損傷〔12〕。因此，下調(diào)炎性因子、阻止炎癥聯(lián)級反應(yīng)，對神經(jīng)細胞具有一定的保護作用〔13〕。ET-1可通過收縮血管，刺激血小板黏附和自由基釋放，使血流量減少，加重腦梗死及周圍組織的缺血、缺氧，促使腦組織和血管內(nèi)皮細胞變性壞死〔14〕。缺血性損傷不僅造成血管內(nèi)皮細胞的損害，刺激內(nèi)皮細胞合成釋放ET-1，而且缺血區(qū)神經(jīng)組織也可因缺氧、軟化和壞死刺激神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生ET-1〔15〕。所以，阻斷ET-1的產(chǎn)生和釋放可減輕腦組織損傷，改善神經(jīng)行為學(xué)功能。本實驗結(jié)果顯示，扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)元的保護作用可能是通過抑制腦內(nèi)TNF-α和ET-1的表達有關(guān)。

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〔2016-05-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on expression of TNF-α and ET-1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats with cerebral ischemia-reperfusion

LIU Chao, LIU Jing-Xia, HEI Chang-Chun,etal.

Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on expression of TNF-α and ET-1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods 60 male SD rats were randomly divided into: sham, model, nimodipine and Zhalinusi Fang groups (n=15). Except sham group, the other groups were fed with high fat-diet for 4 weeks. Then, rat stools were administered intragastrically once a day for three days to make the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome, then focal cerebral ischemia models were established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread. Rats were given with nimodipine (10.8 mg/kg), Zhali Nusi Fang (1.54 g/0.1 kg) by i.g. before the model preparation. Brain were taken at 1, 3, 7 days respectively to determine the brain water content, and then the expression of TNF-α and ET-1 was detected by immunohistochemistry and RT-PCR. Results Compared with sham group, brain water content of model group rats were increased(P<0.01), TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA were up-regulated (P<0.01).Compared with model group, brain water content of Zhali Nusi Fang and nimodipine groups were reduced, TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA were decreased (P<0.01). Compared with nimodipine group, TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA of Zhali Nusi Fang 7 d group were decreased (P<0.05). Conclusions Zhali Nusi Fang has protective effects against the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion, which may be related with inhibiting the expression of TNF-α and ET-1.

Zhali Nusi fang; Cerebral ischemia-reperfusion; Heat-phlegm and sthenic-fu syndrome; Tumor necrosis factor-α; Endothelin-1

國家十二五科技支撐項目(SQ2013SF12E02181)；國家自然科學(xué)基金(81260569)

劉敬霞(1970-)，女，博士，博士后，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

劉 超(1991-)，男，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

R28

A

1005-9202(2017)06-1301-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.001