邵建寧，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，彭章普，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中優(yōu)良乳酸菌的分離篩選

邵建寧，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，彭章普，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

從甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選適合發(fā)酵乳生產(chǎn)的乳酸菌，對(duì)分離純化的乳酸菌進(jìn)行了發(fā)酵性能檢測(cè)，篩選出產(chǎn)酸快、發(fā)酵活力高、凝乳時(shí)間短、后酸化能力弱、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。篩選的6株菌株單菌發(fā)酵牛乳，均在6.5 h內(nèi)凝乳，發(fā)酵乳酸度＞70°T，乳酸菌活菌數(shù)＞1×108CFU/mL，發(fā)酵乳組織狀態(tài)、滋味、氣味等感官指標(biāo)良好，可作為生產(chǎn)發(fā)酵乳的優(yōu)良乳酸菌菌種進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品；乳酸菌；分離；篩選；發(fā)酵性能

乳酸菌是發(fā)酵糖類(lèi)主要產(chǎn)物為乳酸的一類(lèi)無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)，是發(fā)酵乳產(chǎn)品產(chǎn)酸、產(chǎn)粘和產(chǎn)香的基礎(chǔ)和主要原因，在發(fā)酵乳生產(chǎn)過(guò)程中的作用非常重要，發(fā)酵乳的品質(zhì)主要是由乳酸菌作用的結(jié)果決定[1-4]。從自然環(huán)境，特別是從具有悠久歷史的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離、篩選出優(yōu)良乳酸菌種，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛重視[5-8]。甘肅牧區(qū)根據(jù)地理位置分為甘南牧區(qū)和河西牧區(qū)，具有獨(dú)特的地理生態(tài)環(huán)境，當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族牧民沿用傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作發(fā)酵乳品，這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，蘊(yùn)藏了大量未知、有待開(kāi)發(fā)和利用的乳酸菌資源。本研究從甘肅牧區(qū)選取代表性的采樣地點(diǎn)，采集傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，進(jìn)行產(chǎn)酸能力強(qiáng)、風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)良乳酸菌分離篩選，為發(fā)酵乳工業(yè)化生產(chǎn)和新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良菌株，也為科學(xué)地開(kāi)發(fā)與利用牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌資源提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

樣品采自甘肅牧區(qū)牧民自制傳統(tǒng)發(fā)酵乳，甘南牧區(qū)樣品19份，河西牧區(qū)樣品19份，采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品分裝于滅菌的離心管內(nèi)，密封后放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室分別于4℃和-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、BCG牛乳培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

脫脂乳培養(yǎng)基：將脫脂奶粉和水按1∶8（g∶mL）配成脫脂乳，115℃，高壓蒸汽滅菌10～20 min，冷卻備用。脫脂奶粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠(chǎng)；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工廠(chǎng)。所用化學(xué)試劑為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；DELTA320pH計(jì)：梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）集團(tuán)；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；DG-1多功能培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械修造廠(chǎng)；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離純化

（1）分離

取采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳1 mL，和9 mL無(wú)菌生理鹽水混勻，以10倍梯度稀釋?zhuān)x取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度，各稀釋度取0.2 mL分別均勻涂布于BCG牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，30℃平板倒置培養(yǎng)48 h，選擇平板上菌落周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色的單菌落進(jìn)行保存。

（2）純化

對(duì)分離的菌株分別在MRS培養(yǎng)基平板上和M17培養(yǎng)基平板上，劃線(xiàn)分離純化2～3次，同一平板劃線(xiàn)培養(yǎng)后所形成的全部菌落形態(tài)一致或相似，鏡檢全部的細(xì)胞個(gè)體形態(tài)相似，染色反應(yīng)一致，確認(rèn)為純種后，將純化菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中凝乳后4℃保存?zhèn)溆煤蚆RS或M17液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后采用甘油法進(jìn)行保藏[9]。

1.3.2 篩選

（1）初篩

將上述分離純化得到的菌株轉(zhuǎn)接到脫脂乳培養(yǎng)基試管中，37℃條件下培養(yǎng)，若脫脂乳培養(yǎng)基凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或球狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性，初步判斷分離純化出的菌株為乳酸菌[10-11]。

（2）復(fù)篩Ⅰ

將初篩得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，包括凝乳時(shí)間、酸度、刃天青還原時(shí)間測(cè)定。

凝乳時(shí)間的測(cè)定：以肉眼觀(guān)察脫脂乳培養(yǎng)基變黏稠，呈凝膠狀，即已達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，記錄用脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)至脫脂乳凝固的時(shí)間，選擇8 h內(nèi)能凝乳的菌株。

酸度測(cè)定：初篩得到的菌株按5%（V/V）接種量接種于無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵至脫脂乳凝固，采用酸堿中和法，酸度以吉爾涅爾度（°T）表示，選擇酸度＞50°T的菌株。

刃天青還原實(shí)驗(yàn)：取l mL菌株培養(yǎng)液加入9 mL滅菌脫脂乳培養(yǎng)基試管中，再加入刃天青標(biāo)準(zhǔn)溶液l mL，將試管置于37℃水浴保溫，出現(xiàn)淡粉紅色為還原終點(diǎn)，選擇還原終點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間在50 min內(nèi)的菌株[12-13]。

（3）復(fù)篩Ⅱ

將復(fù)篩Ⅰ得到的菌株進(jìn)行酸乳發(fā)酵，通過(guò)感官檢驗(yàn)，篩選出風(fēng)味及組織狀態(tài)比較好，適宜用于生產(chǎn)的優(yōu)良乳酸菌株。將生牛乳原料奶預(yù)熱65℃，加入5%蔗糖，95℃維持5min滅菌，滅菌后立即冷卻至37℃，復(fù)篩Ⅰ菌株以5%（V/V）接種量接入滅菌冷卻后的牛乳中，在37℃發(fā)酵溫度下進(jìn)行發(fā)酵，牛乳凝固后，4℃冷藏后熟24 h。進(jìn)行色澤、組織狀態(tài)、滋味和氣味檢驗(yàn)。色澤和組織狀態(tài)檢驗(yàn)取適量酸奶于50 mL燒杯中，在自然光下觀(guān)察色澤和組織狀態(tài)。滋味和氣味檢驗(yàn)取適量酸奶于50 mL燒杯中，先聞氣味，然后用溫開(kāi)水漱口，再品嘗樣品的滋味[14]。

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）活菌數(shù)測(cè)定

取1mL待測(cè)定樣品，加入含9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液置于MRS或M17瓊脂平板上，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開(kāi)，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[15-16]。

（2）pH值測(cè)定

樣品pH測(cè)定，無(wú)菌取樣5mL，用pH計(jì)測(cè)定樣品的pH值。

（3）菌株性能檢測(cè)

發(fā)酵性能檢測(cè)：將篩選菌株以5%（V/V）接種量接入滅菌冷卻后的牛乳中，在37℃發(fā)酵溫度下進(jìn)行發(fā)酵，牛乳凝固后，記錄凝乳時(shí)間。4℃冷藏后熟24 h，測(cè)定發(fā)酵乳酸度、pH值及活菌數(shù)，綜合發(fā)酵乳感官指標(biāo)、凝乳時(shí)間、活菌數(shù)、酸度、pH值，評(píng)價(jià)篩選菌株發(fā)酵性能。

后酸化能力測(cè)定：將篩選菌株按5%（V/V）接種量接到滅菌牛奶中，在37℃條件下發(fā)酵至凝乳后，迅速放入4℃冷卻保存。測(cè)定酸奶在冷藏1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d后的酸度，通過(guò)酸奶在冷藏過(guò)程酸度的增加值來(lái)判斷菌株后酸化能力的強(qiáng)弱。

活菌保持性：將篩選菌株發(fā)酵乳，在4℃條件下貯存，測(cè)定貯存1 d、3 d、5 d、7 d、15 d樣品中乳酸菌活菌數(shù)。

遺傳穩(wěn)定性：將復(fù)篩到的菌株，分別接種MRS或M17液體培養(yǎng)基中，37℃條件培下養(yǎng)24 h，在上述條件下連續(xù)傳代5次，每代進(jìn)行牛乳發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵乳酸度和活菌數(shù)，檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化

本實(shí)驗(yàn)從甘肅牧區(qū)采集的38份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品中進(jìn)行乳酸菌分離純化，從BCG牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上選擇平板上菌落周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色的單菌落進(jìn)行保存，對(duì)分離的菌株分別在MRS培養(yǎng)基平板上和M17培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)分離純化，對(duì)菌落形態(tài)一致或相似，顯微鏡油鏡下觀(guān)察全部細(xì)胞個(gè)體形態(tài)相似，染色反應(yīng)一致，確認(rèn)為純種。從MRS培養(yǎng)基中分離得到111株桿菌，從M17培養(yǎng)基中分離得到37株球菌，最終分離純化出148株菌株。從分離純化菌株數(shù)量分析，其中桿菌較多，球菌較少。

2.2 乳酸菌篩選

2.2.1 初篩

將分離純化得到的菌株轉(zhuǎn)接到脫脂乳培養(yǎng)基試管中，37℃條件下培養(yǎng)，挑選出脫脂乳培養(yǎng)基凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，鏡檢細(xì)胞桿狀或球狀，革蘭氏染色陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性的菌株，初步判斷為乳酸菌，進(jìn)行保藏。通過(guò)初篩得到乳酸菌96株，其中桿菌79株，球菌17株。

2.2.2 復(fù)篩Ⅰ

將初篩到的菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中37℃條件下靜置培養(yǎng)，進(jìn)行凝乳時(shí)間、酸度、刃天青還原時(shí)間測(cè)定。挑選在8 h內(nèi)凝乳、刃天青還原時(shí)間在50 min內(nèi)，酸度＞50°T的菌株，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，復(fù)篩出15株發(fā)酵活力、產(chǎn)酸性能較好的菌株。其中菌株LQ15、XC35、OL16、OL38、ZGN14、ZGN24、XH16、SB5、SB6、SN31為桿菌，菌株SB1、SN32、LQ24、XC34、ZGN17為球菌。

表1 不同篩選菌株發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of fermentation performances of different screening strains

2.2.3 復(fù)篩Ⅱ

對(duì)復(fù)篩Ⅰ篩選的菌株進(jìn)行酸乳發(fā)酵，通過(guò)感官檢驗(yàn)，篩選出風(fēng)味及組織狀態(tài)比較好，適宜用于生產(chǎn)的優(yōu)良乳酸菌菌株，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，乳酸球菌XC34、SB1發(fā)酵乳香味較濃，酸味適中。乳酸桿菌LQ15、XC35、ZGN14、XH16發(fā)酵乳組織狀態(tài)凝乳良好、均勻細(xì)膩，酸味適中。乳酸球菌XC34、SB1和乳酸桿菌LQ15、XC35、ZGN14、XH16發(fā)酵活力較高、發(fā)酵乳組織狀態(tài)及風(fēng)味較好，可作發(fā)酵乳生產(chǎn)菌株。篩選出的6株菌株單菌發(fā)酵牛乳凝乳酸度值均＞70°T，達(dá)到了GB 19302—2010《發(fā)酵乳》中對(duì)發(fā)酵乳酸度＞70°T的要求。

表2 不同復(fù)篩菌株酸乳品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of fermented milk quality by different secondary screening strains

2.3 篩選菌株單菌發(fā)酵性能

2.3.1 單菌產(chǎn)酸能力

乳酸菌的產(chǎn)酸特性是發(fā)酵乳生產(chǎn)菌種的重要指標(biāo)，菌株的產(chǎn)酸特性直接決定酸乳的凝乳時(shí)間、風(fēng)味及凝乳狀態(tài)。篩選6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）以5%（V/V）接種量接入滅菌冷卻后的牛乳中，在37℃溫度下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵乳酸度，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，6株菌株8 h內(nèi)酸度變化都呈上升趨勢(shì)，其中菌株XC35、ZGN14、XH16三株菌株變化幅度較大，說(shuō)明這3株菌株發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，活力較好。菌株XC35、ZGN14、XH16在發(fā)酵前4 h產(chǎn)酸速率緩慢，酸度較低，發(fā)酵5 h后，酸度上升很快，菌株XC35、ZGN14在發(fā)酵7 h時(shí)酸度分別為83.3°T和83.8°T，菌株XH16在發(fā)酵8 h時(shí)酸度為85.8°T。結(jié)果表明，菌株XC35、ZGN14、XH16較菌株XC34、SB1、LQ15產(chǎn)酸能力強(qiáng)，產(chǎn)酸速度快，凝乳時(shí)間短。

圖1 篩選菌株發(fā)酵酸乳在發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化Fig.1 Changes of acidity of fermented milk by different screened strains during fermentation process

2.3.2 單菌后酸化能力

含活菌的發(fā)酵乳制品，正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售過(guò)程中，雖然環(huán)境溫度比較低，但是菌體仍然能夠利用殘存的糖類(lèi)進(jìn)行緩慢發(fā)酵，從而繼續(xù)產(chǎn)生乳酸，使得發(fā)酵乳的酸度繼續(xù)升高，發(fā)生后酸化現(xiàn)象，即發(fā)酵乳的pH值繼續(xù)下降，可能因酸度偏高導(dǎo)致酸奶風(fēng)味的變化，且酸味太重會(huì)影響消費(fèi)者的口感出現(xiàn)過(guò)酸味及感官質(zhì)量下降。低后酸化是發(fā)酵乳的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）進(jìn)行了后酸化能力檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 篩選菌株發(fā)酵酸乳在冷藏過(guò)程中酸度得變化Fig.2 Changes of acidity of fermented milk by different screened strains during cold storage process

由圖2可以看出，菌株XC35、ZGN14、XH16酸度變化較大，分別為23.1°T、19.0°T、22.0°T。菌株LQ15、XC34、SB1酸度變化分別為13.9°T、10.5°T、10.1°T，表現(xiàn)出弱后酸化能力。菌株XC35、ZGN14、XH16后酸化能力檢測(cè)中酸度變化較大，生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)適合和產(chǎn)酸能力弱、產(chǎn)粘性能好的菌株復(fù)配，并應(yīng)適當(dāng)降低其配比比例。LQ15、XC34、SB1表現(xiàn)出良好的低后酸化性，在和其他乳酸菌株復(fù)配發(fā)酵酸乳時(shí)可適當(dāng)提高其所占比例。

2.3.3 單菌發(fā)酵乳評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）進(jìn)行單菌發(fā)酵，將篩選菌株以5%（V/V）接種量分別接入滅菌冷卻后的牛乳中，在37℃發(fā)酵溫度下進(jìn)行發(fā)酵，牛乳凝固后，記錄凝乳時(shí)間。4℃冷藏后熟24 h，測(cè)定發(fā)酵乳酸度及活菌數(shù)，并進(jìn)行感官檢驗(yàn)，綜合發(fā)酵乳感官指標(biāo)、凝乳時(shí)間、活菌數(shù)、酸度，評(píng)價(jià)篩選菌株發(fā)酵性能，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，篩選菌株單菌株均能在6.5 h內(nèi)凝乳，發(fā)酵乳組織狀態(tài)較好，凝乳完整，風(fēng)味較好。在4℃冷藏24 h后滴定酸度均＞70°T，活菌數(shù)＞1×108CFU/mL。其中菌株LQ15、XC35、ZGN14、XH16凝乳結(jié)實(shí)，均勻細(xì)膩。菌株XC34、SB1較黏稠，口感柔和，酸奶香味較濃。結(jié)果表明，6株菌株均適合作為發(fā)酵乳的生產(chǎn)菌種。

表3 單菌株發(fā)酵酸乳品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Determination results of fermented milk quality by single strain

2.3.4 菌株遺傳穩(wěn)定性

將乳酸桿菌XC35、ZGN14、XH16、LQ15接種到MRS液體培養(yǎng)基，乳酸球菌XC34、SB1接種到M17液體培養(yǎng)基中，37℃條件培下養(yǎng)24 h，在上述條件下連續(xù)傳代5次，每代菌株進(jìn)行牛乳發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵乳酸度和活菌數(shù)，作為檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，實(shí)驗(yàn)菌株通過(guò)5次傳代后，發(fā)酵乳酸度均＞70°T，活菌數(shù)＞1×108CFU/mL。在傳代次數(shù)5次內(nèi)的，6株篩選菌株產(chǎn)酸能力保持穩(wěn)定，其變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）均＜10%。結(jié)果表明，6株篩選菌株均有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表4 篩選菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 4 Inheritance stability of screened strains

3 結(jié)論

從甘肅牧區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出6株發(fā)酵性能優(yōu)良乳酸菌，其中桿菌4株，球菌2株。以5%（V/V）接種量，37℃條件下單菌發(fā)酵牛乳，在6.5 h內(nèi)凝乳，發(fā)酵乳酸度＞70°T，活菌數(shù)＞1×108CFU/mL，發(fā)酵乳組織狀態(tài)較好，凝乳完整，風(fēng)味較好，篩選的菌株具有產(chǎn)酸能力強(qiáng)、后酸化能力較弱、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)良性能，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，可作為發(fā)酵乳工業(yè)生產(chǎn)用備選菌株。

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[16]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 4789.2—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

Isolation and screening of excellent lactic acid bacteria from traditional fermented dairy products in Gansu pastoral area

SHAO Jianning,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,PENG Zhangpu,ZHAO Haoxing
(Institute of Biology,Gansu Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

The lactic acid bacteria suitable for fermented milk production from traditional fermented dairy products in Gansu pastoral area were isolated and screened,and their fermentation performances were detected.The lactic acid bacteria screened had fast acid production rate,high fermentation activity,short curd time,weak postacidification ability and stable inheritable character.The six strains of lactic acid bacteria were screened.The fermented milks by six individual strain were all curded within 6.5 h,the acidity of fermented milk was more than 70°T,the viable counts of lactic acid bacteria were more than 1×108CFU/ml.The sensory indexes(including texture,taste,smell,etc)of fermented milk were good.The six strains could be used as excellent lactic acid bacteria for producing fermented milk to be developed and utilized.

traditional fermented dairy products;lactic acid bacteria;isolation;screening;fermentation performance

Q939.97

0254-5071（2017）03-0075-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.016

2016-11-16

甘肅省自然科學(xué)基金（1208RJZA291）；甘肅省科學(xué)院應(yīng)用研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2013JK-03）

邵建寧（1971-），男，高級(jí)工程師，本科，主要從事生物工程應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。