魏琳娜 汪洋 魏登邦， 魏蓮 王寧 索有瑞

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

高原鼢鼠組織中透明質(zhì)酸提取工藝及分子表征

魏琳娜1汪洋1魏登邦1，2魏蓮1王寧1索有瑞2

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

旨在建立高原鼢鼠組織中透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）提取工藝。采用單因素試驗(yàn)確定粗提、酶解和除雜等工藝的最佳條件，通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化粗提和酶解工藝條件。通過紅外分光光度法確定HA的分子結(jié)構(gòu)，Bitter-Muir法確定其葡萄糖醛酸的含量，黏度法和體積排阻色譜法確定透明質(zhì)酸的分子量。高原鼢鼠最佳粗取工藝∶液料比4 mL/g（水/動(dòng)物組織，V/ W），提取溫度26℃，提取時(shí)間1.6 h；最佳酶解工藝：酶解溫度37℃，pH8.7，加酶量0.7%（1∶250 胰蛋白酶/動(dòng)物組織，W/W）；最佳除雜工藝為：氯苯體積20%（氯苯/HA水溶液，V/V），以3倍體積95%乙醇沉淀，以7%活性碳（活性碳/HA水溶液，W/ V）除雜，透析時(shí)間3 h。在此工藝條件下，每500 g 高原鼢鼠組織可得到（144±3.61）mg HA粉末。平均回收率為72.73%。紅外圖譜顯示提取物具有與Sigma公司的HA標(biāo)準(zhǔn)品一致的吸收峰，葡萄糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.60%，蛋白質(zhì)含量為0.11%，其分子量達(dá)到3×106Da。本工藝提取的高原鼢鼠組織來源的HA回收率好，純度高；高原鼢鼠組織中HA分子量大，含量高。

高原鼢鼠；透明質(zhì)酸（HA）；提取工藝；表征方法

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA），又名玻璃酸，是一種線性大分子酸性黏多糖，由（1-β-4）-D-2葡萄糖醛酸（1-β-3）-N-乙?；?D-氨基葡萄糖的雙糖單位重復(fù)連接組成［1］。HA廣泛存在于動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞間質(zhì)中，在牛眼玻璃體、皮膚、臍帶、軟骨和關(guān)節(jié)滑液中含量較高。對不同組織來源的HA進(jìn)行的結(jié)構(gòu)測定表明，其結(jié)構(gòu)均一致，沒有種屬差異，只存在相對分子量的不同，雙糖單位可達(dá)25 000之多，在體內(nèi)透明質(zhì)酸的分子量5-20 000 kD［2，3］。1934年Meyer和Palmer［4］首先自牛眼玻璃體內(nèi)提取分離得到該物質(zhì)，此后對HA的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)、生理作用、制備工藝及其應(yīng)用方面進(jìn)行了深入的研究［5］。目前，HA已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和高級化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域。在機(jī)體內(nèi)HA是一種多功能基質(zhì)，顯示出多種重要的生理功能，例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，協(xié)助水電解質(zhì)的擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，潤滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，促進(jìn)傷口愈合等［6-9］。尤為重要的是，HA具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子［6，7］。透明質(zhì)酸溶于水、不溶于有機(jī)溶劑，具有許多天然粘多糖共有的性質(zhì)。從生物體提取的HA呈白色，無異味、具有較強(qiáng)的吸濕性。HA在氯化鈉溶液中由于葡萄糖醛酸中的羧基基團(tuán)解離，產(chǎn)生H+使得呈現(xiàn)為酸性多聚陰離子狀態(tài)，賦予了HA酸性黏多糖的性質(zhì)［10］。研究表明，HA吸附的水分約為其本身重量的1 000倍，這是其它多糖類化合物無法比擬的。

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）屬嚙齒目，倉鼠科，鼢鼠屬，是青藏高原特有的地下鼠，終生生活在封閉的地下洞道中，其地下洞道生境的顯著特征是低氧、高二氧化碳和高濕度，洞道內(nèi)含氧量比同地區(qū)大氣中低20%，而CO2含量平均高于同地區(qū)大氣中CO2含量7.3-48.6倍［16］。大量的研究表明高原鼢鼠對低氧高二氧化碳環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性［17-26］，其骨骼已成為虎骨的替代品，目前已用于治療骨性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中。裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）也是一種地下鼠，主要分布在非洲中東部。最近，國外對裸鼢鼠的研究結(jié)果表明，裸鼢鼠皮膚、心臟、肝臟、肺、肌肉等組織中均含有高含量的 HMM-HA（high molecular masshyaluronan，HMMHA），其分子量為6-12 MDa［12］，而小鼠等其他動(dòng)物細(xì)胞分泌的HA分子量范圍為0.5-3 MDa。裸鼢鼠分子量的透明質(zhì)酸抑制腫瘤細(xì)胞生長及擴(kuò)散［12］。研究發(fā)現(xiàn)，除裸鼢鼠外的很多地下鼠組織都合成分泌HMM-HA［15］。本研究以地下鼠高原鼢鼠組織為原料，明確高原鼢鼠組織中HA的分子量大小及組織中的含量，旨在為開發(fā)利用高原鼢鼠資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高原鼢鼠捕捉于青海省西寧市湟源區(qū)宗家溝（北緯36°43'，東經(jīng)101°17'，海拔3 500 m）。動(dòng)物用5%戊巴比妥鈉麻醉處死，采集各組織樣品，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的組織樣品立即放入液氮保存，透明質(zhì)酸提取的組織樣品放入-20℃冰箱冷凍保存。采樣過程中所涉及到處理動(dòng)物的措施均按照國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例（GB14923-2010）》執(zhí)行。

主要試劑：葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒；四硼酸鈉；胰蛋白酶；濃硫酸；咔唑；濃鹽酸；氫氧化鈉；無水乙醇；氯苯；丙酮；NaCl；EDTA-Na2；活性炭；高嶺土；碳酸鈉；碳酸氫鈉；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；試劑配置用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 HA提取工藝 高原鼢鼠處死后，去掉頭顱、皮膚、胃腸、膀胱，剩余部分洗凈絞碎后整體絞碎成肉糜狀，即為原料。其工藝過程為：HA粗提→蛋白質(zhì)酶解→除脂→除多肽→除核酸→透析精制→冷凍干燥。

1.2.1.1 粗提工藝的優(yōu)化 取5份高原鼢鼠組織，每份80 g，加入適量蒸餾水及0.5 g EDTA-Na2、3 g NaCl，在組織搗碎機(jī)內(nèi)以10 000 r/min搗5-10 min后，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。向上清液中補(bǔ)加1.6 g NaCl。取上述提取液加入3倍體積的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇，靜置至沉淀析出，于6 000 r/min 離心15 min，沉淀為HA粗提物。

以HA粗提物為原料，選取提取液料比（2.5、3、3.5、4、4.5 mL/g），提取溫度（15、20、25、30、35℃），靜置時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h），提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）作為參考因素考察HA粗提工藝的單因素分析。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選主要影響的單因素，應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，反映多個(gè)因素之間相互作用的影響，確定高原鼢鼠組織中HA粗提工藝的提取條件。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 HA粗提工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

1.2.1.2 酶解工藝的優(yōu)化 配制c（NaHCO3）= 0.05 mol/L，c（Na2CO3）= 0.05 mol/L，V（NaHCO3）∶V（Na2CO3）= 45∶5，pH 8.7。將粗提工藝得到的提取物按照相當(dāng)于原動(dòng)物組織量（g）：堿性緩沖液（mL）=1∶1的比例加入上述緩沖液，溶解粗提物后按120 r/min 攪拌速度進(jìn)行酶解。

以HA粗提物為原料，選取酶解溫度（31、33、35、37、39℃）、酶解pH值（8.3、8.5、8.7、8.9、9.1）、酶解時(shí)間（5、10、15、20、25 h）、加酶量（1∶250）（加酶量：原動(dòng)物組織量=0.4、0.5、0.6、0.7、0.8%）作為參考因素考察HA酶解的單因素分析。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選主要影響的單因素，確定高原鼢鼠組織中HA粗提工藝的最佳提取條件。試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 蛋白質(zhì)酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

1.2.1.3 除雜工藝的優(yōu)化

（1）除脂及非水溶性雜質(zhì)：向酶解液中加入酶解液體積10%、20%、30%、40%、50% 的氯苯，考察加入不同氯苯加入量對HA得率的影響，以800-1 000 r/min攪拌30 min，再于6 000 r/min離心20 min，抽取上清液。上清液中加入氯化鈉至終濃度為0.2 mol/L，攪拌溶解后加3倍體積的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇，攪拌，靜置1 h，于6 000 r/min離心10 min，傾棄上清液，取固形物即得1次初級HA。

（2）除多肽：向1次初級沉淀中加入相當(dāng)于原動(dòng)物組織量（g）／配比緩沖液（mL）=1∶3的［ρ（NaCl）=11.6 g/L，ρ（Na2HPO4·12H2O）= 0.55 g/L，ρ（NaH2PO4·2H2O）= 0.06 g/L，V（NaCl）∶V（Na2HPO4·12H2O）∶V（NaH2PO4·2H2O）=1∶1∶1］3種含鹽緩沖水溶液，攪拌至充分溶解，得HA水溶液。考察HA水溶液中加入不同體積倍數(shù)（1、2、3、4、5）的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇對HA得率的影響，攪拌，靜置1 h，于6 000 r/min離心10 min，傾棄上清液，取固形物得到除多肽后的2次初級HA。

（3）除核酸及小分子多肽：向2次初級沉淀中HA水溶液中加入高原鼢鼠組織（g）：配比緩沖液（mL）=2∶1的緩沖溶液［ρ（NaCl）=11.6 g/L，ρ（Na2HPO4·12H2O）=0.55 g/L，ρ（NaH2PO4·2H2O）=0.06 g/L，V（NaCl）∶V（Na2HPO4·12H2O）∶V（NaH2PO4·2H2O）=1∶1∶1］，得HA水溶液。考察在此溶液中加入不同質(zhì)量的經(jīng)稀酸稀堿處理并水洗至中性的活性碳（活性碳量／相當(dāng)于原動(dòng)物組織量=6%、7%、8%、9%、10%）的活性炭和活性碳2倍質(zhì)量數(shù)的經(jīng)稀堿溶液處理并水洗至中性的高嶺土，以60-80 r/min 攪拌30 min，然后于6 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜抽濾，收取濾液即為除核酸及小分子多肽后的初級HA水溶液。

（4）透析精制工藝：將初級HA 水溶液移入50 kD的透析袋中，于1 000 mL去離子水中透析，考察不同透析時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對HA水溶液中蛋白含量的影響。抽取袋內(nèi)保留液即為透析后精制的HA 水溶液。

1.2.1.4 放大實(shí)驗(yàn) 分別取高原鼢鼠絞碎組織3份各500 g，采用優(yōu)化后的工藝流程，考察此工藝流程下高原鼢鼠組織中HA的提取率。

1.2.1.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)采用3次實(shí)驗(yàn)平均測量值。所有工藝均按照Bitter-Muir咔唑法測定葡萄糖醛酸的含量［29］，根據(jù)各步驟提取物中的葡萄糖醛酸的含量并計(jì)算HA提取量［28，29］。透明質(zhì)酸提取率=HA提取量/高原鼢鼠組織濕重，單位mg/g。蛋白含量按照考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）［30］檢測（南京建成生物工程有限公司），單位g/L。響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)通過Statistic 7.0軟件進(jìn)行計(jì)算和分析處理，系數(shù)的顯著性通過t檢驗(yàn)和P值進(jìn)行分析。

1.2.2 透明質(zhì)酸的鑒定 采用Thermo Nicolet iS50（USA）型傅立葉變換紅外光譜儀［27］和Shimadzu UV-2550（Japan）紫外分光光度儀檢測［31］的方法分別測定HA紅外光譜和紫外光譜吸收特征。

1.2.3 透明質(zhì)酸的分子量表征

1.2.3.1 黏度法測定HA分子量 根據(jù)文獻(xiàn)［32］方法進(jìn)行測定。

1.2.3.2 SEC-MALLS法測定HA分子量 色譜柱：Shodex SB-806M HQ：13 μm particle size，15 000? pore size和 Shodex SB-807 HQ：35 μm particle size，30 000? pore size（Showa Denko，Japan）串聯(lián)使用。流動(dòng)相：0.1 mol/L 的氯化鈉溶液，0.22 μm 濾膜過濾，待用；流速0.6 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量500 μL。檢測器：Waters 2410示差折光檢測器、DAWN EOS型多角度激光光散射儀（激光波長為690 nm，25℃條件下進(jìn)行）串聯(lián)在線檢測。折光指數(shù)增量dn/dc設(shè)為0.15。

用于溶解透明質(zhì)酸樣品的溶劑采用0.1 mol/L NaCl溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后備用。取透明質(zhì)酸樣品加入溶劑配制成0.1 mg/mL 的HA-NaCl溶液，置于混合器上混合放置24 h，直至樣品完全溶解。所有待測樣品均用 0.45 μm 的濾頭進(jìn)行過濾后進(jìn)樣檢測，待進(jìn)行溫度平衡10 min 后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。系統(tǒng)控制和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集軟件為ASTRA V 4.90.08。

1.2.4 HA純度測定

1.2.4.1 葡萄糖醛酸含量的測定 參照Bitter-Muir咔唑法［28］。以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，建立計(jì)算葡萄糖醛酸含量的回歸方程。計(jì)算公式為：HA（%）= 2.159 4×y（HA）×100%，式中：2.159 4為葡萄糖醛酸相對HA的質(zhì)量換算系數(shù)；y（HA）為每毫升HA水溶液試樣中葡萄糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。平行測定3份樣品，計(jì)算平均值，通過HA水溶液中蛋白濃度與HA濃度的比值計(jì)算HA中的蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 粗提工藝

2.1.1 粗提工藝的單因素分析 結(jié)果如圖1所示，當(dāng)其它條件不變時(shí)，溫度選擇25℃，液料比選擇4 mL/g，靜置時(shí)間選擇1.5 h，提取次數(shù)為3 次時(shí)，粗提物中HA含量最高。

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化HA粗提工藝

2.1.2.1 粗提工藝響應(yīng)面分析 通過上述的單因素分析，篩選了提取溫度、液料比、靜置時(shí)間三個(gè)主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合相應(yīng)面法，以HA提取率為相應(yīng)值，對HA粗提工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如下（表3，表4）。

采 用 Design-Expert 8.0 軟 件 對 各 因 素進(jìn)行回歸擬合得回歸方程，HA提取得率=0.34+0.0077A+0.011B+0.010C+0.0059AB-0.0047AC+0.0073BC-0.062A2-0.030B2-0.046C2。

表4中的回歸方差分析的結(jié)果表明，A，B，C，A2，B2，C2（P＜0.01）為極顯著項(xiàng)；AB，BC（P＜0.05）為顯著項(xiàng)；AC項(xiàng)不顯著。R2=0.990 0，r=0.995 0表明該二次回歸方程得到的HA提取率模型與實(shí)際擬合較好，符合度為99.50%，說明該使用方程模擬實(shí)際是可行的。同時(shí)，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對HA取得率的影響順序?yàn)橐毫媳龋˙）＞靜置時(shí)間（C）＞提取溫度（A）。

2.1.2.2 HA粗提工藝條件的確定 通過軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件：液料比4.03 mL/g，溫度26.04℃，提取時(shí)間1.56 h。在此工藝下高原鼢鼠組織中HA含量為0.338 mg/g。

2.1.2.3 粗提工藝驗(yàn)證 綜合考慮時(shí)間，成本等因素，對工藝參數(shù)進(jìn)行了一定的修正，確定適宜的提取工藝條件為：液料比4 mL/g，提取溫度26℃，提取時(shí)間為1.6 h。在此條件下，進(jìn)行了3次平行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示粗提工藝的平均含量為（0.335±0.018）mg/g。按照Bitter-Muir咔唑法計(jì)算得到高原鼢鼠整體組織中HA的實(shí)際含量為0.396 mg/g，平均回收率為84.60%。

2.2 蛋白酶解工藝

2.2.1 蛋白酶解工藝的單因素分析 當(dāng)其它條件不變，在酶解溫度選擇37℃，pH值為8.7，加酶量選擇0.7%，酶解時(shí)間選擇20 h 時(shí)，酶解產(chǎn)物HA含量最高（圖2）。

圖1 不同提取條件對粗提物中HA含量的影響

表3 粗提工藝的分析方案與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化HA酶解工藝條件

2.2.2.1 酶解工藝響應(yīng)面分析 通過上述的單因素分析，篩選了酶解溫度、酶解pH值、加酶量3個(gè)主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法，以HA提取率為響應(yīng)值，對HA粗提工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下（表5，表6）。

采 用Design-Expert 8.0 軟 件 對 各 因 素 進(jìn)行回歸擬合得回歸方程，酶解工藝下HA提取 得 率 =0.33-0.0039A+0.0073B+0.0038C-0.0077AB+0.015AC-0.0079BC-0.034A2-0.030B2-0.021C2。

表6中的回歸方差分析的結(jié)果表明，B、AB、BC、AC、A2、B2、C2（P＜0.01）為極顯著項(xiàng)；A、C（P＜0.05）為顯著項(xiàng)。R2=0.980 5，r=0.990 2表明該二次回歸方程得到的HA提取得率模型與實(shí)際擬合較好，符合度為99.02% 說明該使用方程模擬實(shí)際是可行的。同時(shí)，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對HA提取率的影響順序?yàn)閜H值（B）＞加酶量（A）＞酶解溫度（C）。

2.2.2.2 HA酶解工藝條件的確定 通過軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出最優(yōu)酶解工藝條件為酶解溫度36.88℃，pH值8.72，加酶量為0.7%。在此工藝下高原鼢鼠組織中HA含量為0.326 mg/g。

表4 粗提工藝的方差分析結(jié)果

圖2 不同酶解條件對提取物中HA含量的影響

2.2.2.3 酶解工藝驗(yàn)證 綜合考慮時(shí)間，成本等因素，對工藝參數(shù)進(jìn)行了一定的修正，確定適宜的酶解工藝條件為：酶解溫度37℃，pH值8.7，加酶量為0.7%。在此條件下，進(jìn)行了3次平行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示粗提工藝的平均含量為（0.318±0.015）mg/g。平均回收率為80.30%。

表5 酶解工藝的分析方案與結(jié)果

表6 酶解工藝的方差分析結(jié)果

2.3 純化工藝

2.3.1 除脂 當(dāng)氯苯的加入量分別為酶解液體積的10%-20% 時(shí)，透明質(zhì)酸的提取率逐漸增加，到20%時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著氯苯量的增加出現(xiàn)先少量下降，后保持不變的狀態(tài)（圖3）。說明當(dāng)氯苯加入量達(dá)到20% 時(shí)，能將HA水溶液中的脂類和非極性物質(zhì)完全去除。為節(jié)約成本，減少工業(yè)污染，氯苯加入的體積數(shù)為酶解液的20% 為最佳。

2.3.2 除多肽 當(dāng)加入2-4倍HA水溶液體積數(shù)的95% 乙醇除多肽時(shí)，表現(xiàn)為加入2-3 倍95% 乙醇醇沉?xí)r，HA提取率緩慢上升，蛋白含量顯著下降；加入3 倍95% 乙醇時(shí)，HA含量達(dá)到峰值，蛋白含量達(dá)到最小值（圖4）。3 倍體積數(shù)的95% 乙醇醇沉能達(dá)到最大的HA提取率和最小的蛋白含量。因此，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，提高產(chǎn)品得率，除多肽時(shí)選擇3倍乙醇量為最佳。

2.3.3 除核酸 當(dāng)加入6%-8% 活性碳除核酸時(shí)，HA的提取率保持不變，在此活性炭加入量下HA不會(huì)被活性碳吸附；當(dāng)活性炭加入量超過8% 時(shí)，HA提取率逐漸下降（圖5），說明在此加入量下活性碳已將HA吸附，造成一定的HA損失。為提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少損失，活性碳的加入量以7% 為宜。

2.3.4 透析 當(dāng)透析時(shí)間在1-3 h 時(shí)，HA水溶液中的蛋白濃度顯著下降，直至3 h 后保持穩(wěn)定不變（圖6），說明3 h 的透析時(shí)間已將絕大部分蛋白質(zhì)去除。為節(jié)約時(shí)間，減少能耗，透析時(shí)間選擇3 h為宜。

綜合以上工藝，每500 g 高原鼢鼠組織分別得到148 mg，143 mg和141 mg 透明質(zhì)酸粉末。平均回收率為72.73%。

圖3 氯苯加入量對HA得率的影響

圖4 醇沉倍數(shù)對HA含量及蛋白含量的影響

圖5 活性碳加入量對初提水溶液中HA含量的影響

圖6 透析時(shí)間對HA精制水溶液中蛋白含量的影響

2.4 HA的鑒定與分子量表征

2.4.1 高原鼢鼠組織提取的HA主要質(zhì)量指標(biāo) 提取的透明質(zhì)酸外觀為乳白色的粉末；經(jīng)Bitter-Muir咔唑法法檢測，葡萄糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.60%，經(jīng)換算HA濃度為98.47%；其蛋白質(zhì)含量為0.11%，經(jīng)黏度法和體積排阻法檢測，其平均分子量達(dá)到3×106Da，屬高分子量透明質(zhì)酸。

2.4.2 紫外光譜檢測 利用紫外分光光度計(jì)對高原鼢鼠組織中提取并純化的HA在190-400 nm波長內(nèi)掃描，結(jié)果（圖7）顯示在波長196 nm左右處出現(xiàn)多糖特征吸收峰，在260 nm和280 nm 未見有核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，說明純化得到的透明質(zhì)酸基本不含蛋白質(zhì)、核酸類雜質(zhì)。

圖7 高原鼢鼠組織中提取的HA紫外光譜

2.4.3 紅外光譜檢測 將本實(shí)驗(yàn)提取和純化的高原鼢鼠組織中的HA進(jìn)行紅外吸收光譜分析（圖8），HA的紅外吸收圖譜在3 400 cm-1附近有強(qiáng)烈的-OH伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，表明存在著多糖羥基結(jié)構(gòu)。1 654 cm-1及1 560 cm-1處有-C=O和-C-N伸縮振動(dòng)及N-H彎曲振動(dòng)的特征吸收峰，表明存在著乙酰氨基結(jié)構(gòu)。1 412 cm-1和1 384 cm-1有O=C-O-伸縮振動(dòng)-OH彎曲振動(dòng)偶合產(chǎn)生的兩個(gè)吸收峰，表明存在著糖醛酸上的解離羧基和多羥基結(jié)構(gòu)。以上吸收情況與美國Sigma公司的HA標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜（圖9）一致［33］，兩者在特征區(qū)與指紋區(qū)的各主要吸收峰的波長和各吸收峰間的相互強(qiáng)度關(guān)系相同。紅外光譜結(jié)果證明提取物為透明質(zhì)酸。

圖8 高原鼢鼠組織中提取的HA紅外光譜

圖9 HA標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜

2.4.4 黏度法表征分子量 結(jié)果根據(jù)公式η=3.6×10-4Mr0.78，黏度法計(jì)算結(jié)果（圖10）顯示，高原鼢鼠HA的分子量為3.05×106。

圖10 黏度法表征HA分子量結(jié)果

2.4.5 體積排阻色譜法（SEC-MALL）表征分子量 結(jié)果經(jīng)體積排阻色譜（SEC-MALL）鑒定（圖11），高原鼢鼠各組織HA分子量分布于2.671×106-3.015×106Da之間。

3 討論

文獻(xiàn)研究表明，分離純化HA的方法有：季銨鹽法［34］、芳香樹脂和活性炭法［35］、電-膜分離法［36］、離子交換層析法［37］等。然而，從動(dòng)物組織中分離純化HA，純化中使用季銨鹽，不但操作過程復(fù)雜，而且HA損失大；芳香樹脂和活性炭法的HA損失較大；電-膜分離方法純化程度有限；離子交換法操作不穩(wěn)定，不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。本工藝HA提取物中的蛋白質(zhì)被胰蛋白酶分解后，用活性炭能有效去除剩余的大量蛋白質(zhì)和全部核酸，HA的回收率高、純度高、分子量大。本文的方法過程簡捷、條件易于控制、設(shè)備比較簡單，易于放大。

目前，醫(yī)用和用于化妝品的透明質(zhì)酸主要通過微生物發(fā)酵法提取分離，特點(diǎn)是產(chǎn)品不受原料資源限制、工藝簡單并且成本低，但是微生物發(fā)酵法提取的透明質(zhì)酸分子量較?。?8］。生物天然材料提取透明質(zhì)酸主要用提取法從牛眼、豬眼、雞冠、人臍帶天然材料等組織中提取，其透明質(zhì)酸的分子量分別為7.9× 104Da、1.8×105Da、4.7×105Da、1.8×105Da［40］。本研究提取得到的透明質(zhì)酸分子量為3.05×106Da，較微生物發(fā)酵法和其他天然材料組織中的分子量大，屬高分子量透明質(zhì)酸。有研究表明透明質(zhì)酸分子量越大，保水能力越強(qiáng)［41］。因此，從高原鼢鼠組織中提取透明質(zhì)酸可作為高級保水化妝品的天然原料。另外，透明質(zhì)酸具有潤滑關(guān)節(jié)，促進(jìn)傷口愈合等功能。因此，從高原鼢鼠組織中提取高分子量透明質(zhì)酸在臨床上可用于關(guān)節(jié)炎防治和手術(shù)中傷口的愈合。

4 結(jié)論

以HA含量為指標(biāo)，采用粗提、酶解和除雜等工藝提取高原鼢鼠組織透明質(zhì)酸。采用單因素試驗(yàn)確立各水平最佳條件，通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化粗提工藝和酶解工藝。高原鼢鼠最佳粗取工藝為：液料比4 mL/g（水/動(dòng)物組織，V/W），提取溫度26℃，提取時(shí)間1.6 h；最佳酶解工藝：酶解溫度37℃，pH值8.7，加酶量（1∶250 胰蛋白酶/動(dòng)物組織，W/W）0.7%；最佳除雜工藝：氯苯體積（氯苯/ HA水溶液，V/V）20%，以3 倍體積95%乙醇沉淀，以7%活性碳（活性碳/HA水溶液，W/V）除雜，透析時(shí)間3 h。在此工藝下，每500 g 高原鼢鼠組織可得到（144±3.61）mg HA粉末，平均回收率為72.73%。

圖11 高原鼢鼠組織中HA的SEC-MALL圖

高原鼢鼠組織中提取的HA外觀為乳白色的粉末。經(jīng)Bitter-Muir法測定，葡萄糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.60%，經(jīng)換算HA濃度為98.47%；其蛋白質(zhì)含量為0.11%，符合瑞典Healon產(chǎn)品質(zhì)量要求（＜0.5%），達(dá)到了化妝品及食品級標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)黏度法和體積排阻法檢測，其平均分子量達(dá)到3×106Da，屬高分子量HA。

［1］Rapport MM, Weissman B, Linker A, et al. Isolation of a crystalline disaccharide, hyalobiuronic acid fromhyaluronic acid［J］. Nature, 1951, 168：997-997.

［2］Saari H, Konttinen YT, Friman C, et al. Differential effects of reactive oxygen species on native synovial fluid and purified human umbilical cord hyaluronate［J］. Inflammation, 1993, 17（4）：403-415.

［3］Jeon O, Song SJ, Lee KJ, et al. Mechanical properties anddegradation behaviors of hyaluronic acid hydrogels crosslinkedat various crosslinking densities［J］. Carbohydrate Polymers, 2007, 10：251-257.

［4］Meyer K, Palmer JW. The polysaccharide of the vitreous humor［J］. Journal of Biological Chemistry, 1934, 107：629-634.

［5］Weissmann B, Meyer K. The structure of hyalobiuronic acid and of hyaluronic acid from umbilical Cord1, 2［J］. Journal of the American Chemical Society, 1954, 76（7）：1753-1757.

［6］郭學(xué)平, 劉愛華, 凌沛學(xué). 透明質(zhì)酸在化妝品、健康食品和軟組織填充劑中的應(yīng)用［J］. 食品與藥品, 2005, 7（1A）：20-23.

［7］Yamamoto H. Antiaging and cosmetic effects of dietary hyaluronic acid（extracellular matrix extract）［J］. New Food Ind, 1998, 40：33-41.

［8］凌沛學(xué), 賀艷麗, 張青. 透明質(zhì)酸對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用［J］.食品與藥品, 2005, 7（1A）：1-3.

［9］Balazs EA, Miller D and Stegmann R. Viscosurgery and the use of Na-hyaluronate in intraocular lens implantation［J］. Lecture, Cannes, France, 1979, 5：56-59.

［10］Scott JE, Cummings C, Brass A, et al. Secondary and tertiary structures of hyaluronan in aqueous solution, investigated by rotary shadowing-electron microscopy and computer simulation. Hyaluronan is a very efficient network-forming polymer［J］. Biochemical Journal, 1991, 274（3）：699-705.

［11］Buffenstein R, Jarvis JUM. The nakedmole rat—a new record for the oldest living rodent［J］. Sci Aging Knowledge Environ, 2002（21）：pe7.

［12］Buffenstein R. Negligible senescence in the longest living rodent, the naked mole-rat：insights from a successfully aging species［J］. Journal of Comparative Physiology B, 2008, 178, 439-445.

［13］Tian X, Azpurua J, Hine C, et al. High-molecular-mass hyaluronan mediates the cancer resistance of the naked mole rat［J］. Nature, 2013, 499（7458）：346-349.

［14］Holmes MW, Bayliss MT, Muir H. Hyaluronic acid in human articular cartilage. Age-related changes in content and size［J］. Biochemical Journal, 1988, 250, 435-441.

［15］Jiang D, Liang J, Noble PW. Hyaluronan in tissue injury and repair［J］. Annu Rev Cell Dev Biol, 2007, 23：435-461.

［16］曾縉祥, 王祖望, 師治賢. 高山地區(qū)高原鼢鼠的代謝特點(diǎn)及若干生理指標(biāo)的觀察［J］. 高原生物學(xué)集刊, 1984, 3：163-171.

［17］王曉君, 魏登邦, 魏蓮, 等. 高原鼢鼠和高原鼠兔肺細(xì)葉結(jié)構(gòu)特征［J］. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2008, 54（3）：531-539.

［18］齊新章, 王曉君, 朱世海, 等. 高原鼢鼠和高原鼠兔心臟對低氧環(huán)境的適應(yīng)［J］. 生理學(xué)報(bào), 2008, 60（3）：348-354.

［19］魏蓮, 魏登邦, 王曉君, 等. 高原鼢鼠、鼠兔及大鼠心肌和骨骼肌乳酸脫氫酶活力及同工酶譜［J］. 四川動(dòng)物, 2009, 28（1）：64-68.

［20］朱世海, 齊新章, 王曉君, 等. 高原鼢鼠和高原鼠兔骨骼肌攝氧功能差異研究［J］. 生理學(xué)報(bào), 2009, 61（4）：373-378.

［21］鄭亞寧, 朱瑞娟, 王多偉, 等. 高原鼢鼠血管內(nèi)皮生長因子基因編碼和mRNA的表達(dá)以及微血管密度：與其它鼠類的比較［J］. 生理學(xué)報(bào), 2011, 63（2）：155-163.

［22］朱瑞娟, 饒鑫峰, 魏登邦, 等. 高原鼢鼠和高原鼠兔肝臟蘋果酸天冬氨酸穿梭系統(tǒng)的功能差異［J］. 生理學(xué)報(bào), 2012, 64（2）：177-186.

［23］Wei DB, Wei L, Zhang JM. Blood-gas properties of plateau zokor（Myospalax baileyi）［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular & Integrative Physiology, 2006, 145：372-375.

［24］Wang DW, Wei L, Wei DB. Testiss-pecific lactate dehydrogenase is expressed in somatic tissues of plateau pikas［J］. FEBS Open Bio, 2013, 3：118-123.

［25］Sun SZ, Wei L, Wei DB, et al. Differences of glycolysis in skeletal muscle and lactate metabolism in the liver of plateau zokor（Myospalax baileyi）and plateau pika（Ochotona curzoniae）［J］. Acta Physiologica Sinica, 2013, 65（3）：276-284.

［26］Wei DB, Wang DW, Wei L, et al. Differences in physiological adaptive strategies to hypoxic environments in plateau zokor and plateau pika［J］. Science（suppl.）, 2012, 36.

［27］Bitter T, Muir HM. A modified uronic acid carbazole reaction［J］. Analytical Biochemistry, 1962, 4（4）：330-334.

［28］謝音. 食品分析［M］. 北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2006. 79-80.

［29］郭育濤, 陳斌, 江元汝, 等. 從牛眼玻璃體中分離純化透明質(zhì)酸的新方法［J］. 精細(xì)化工, 2008（3）：246-250.

［30］Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］. J Biol Chem, 1951, 193（1）：265-275.

［31］欒途. 透明質(zhì)酸粘多糖的分子表征、流變學(xué)性質(zhì)及其物理凝膠的研究［D］. 上海：上海交通大學(xué), 2011.

［32］盧佳芳, 楊佳玉, 王菁, 等. 魷魚眼透明質(zhì)酸的酶法提取與分離純化［J］. 中國食品學(xué)報(bào), 2010（4）：88-93.

［33］王大為, 張艷榮, 沙坤. 中國林蛙皮多糖類天然保濕因子的提取與鑒定［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 24（6）：99-102.

［34］王繼波. 環(huán)胞苷二棕櫚酸酯脂質(zhì)體粒度分布及微黏度的測定［J］. 精細(xì)化工, 2006, 23（2）：154-156.

［35］蔡明志, 王昆, 黃復(fù)生. 載藥脂質(zhì)體物理化學(xué)穩(wěn)定性的研究進(jìn)展［J］. 國際藥學(xué)研究雜志, 2005, 32（6）：404-407.

［36］ Arifin DR, Palmer AF. Physical properties and stability mechanisms of poly（Ethylene Glycol）conjugated liposome encapsulated hemoglobin dispersions［J］. Artificial Cells Blood Substitutes & Biotechnology, 2005, 33（2）：137-62.

［37］王健, 李明軒. 冷凍干燥對提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究概況［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2005, 36（9）：576-580.

［38］崔媛, 段潛, 李艷輝. 透明質(zhì)酸的研究進(jìn)展［J］. 長春理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 34（3）：101-106.

［39］高玉瓊, 劉建華, 霍昕, 等. 不同組織來源透明質(zhì)酸的分離純化及其鑒定［J］. 生物化學(xué)雜志, 1996, 12（2）：215-218.

［40］黃岳山, 潘藝茗, 薛靜. 不同相對分子量透明質(zhì)酸功能及應(yīng)用的研究［J］. 透析與人工器官, 2011（4）：22-25.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Extraction Process and Molecular Characterization of Hyaluronic Acid in the Plateau Zokor Tissues

WEI Lin-na1WANG Yang1WEI Deng-bang1，2WEI Lian1WANG Ning1SUO You-rui2
（1. College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016；2. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture，Qinghai University，Xining 810016）

We aim to establish an extraction process of hyaluronic acid（HA）from the tissues of plateau zokor（Myospalax baileyi）. One-factor experiments were used to determine the optimal conditions of crude extraction，enzymolysis，and edulcoration process，and response surface method was applied to further optimize the crude extraction and enzymolysis process. The molecular structure of the extracted HA was determined by infrared spectrophotometry，the content of glucuronic acid by the Bitter-Muir method，and the molecular weight by the method of viscosity and size exclusion chromatography. As results，the optimal conditions of crude extraction was: liquid/material ratio 4 mL/g（water/tissues，V/W），extraction temperature 26℃，and extraction time 1.6 h. The optimal enzymolysis process was: temperature 37℃，pH 8.7，and 0.7% added enzyme（1:250 trypsasy/tissue，W/W）. The optimal edulcoration process was: 20% chlorobenzene（chlorobenzene/ HA solution，V/V），95% alcohol precipitation ratio in 3 times volume，7% activated carbon（activated carbon/HA solution，W/V）to do edulcoration，and dialysis for 3 h. Under above optimal conditions，144 ± 3.61 mg HA powder was obtained from 500 g tissues of plateau zokor，and the average recovery rate was 72.73%. Infrared spectrum displayed the same absorption peak of HA by standard samples from Sigma. The mass fraction of glucuronic acid was 45.60%，and the protein content was 0.11%. The molecular weight of hyaluronic acid reached 3×106 Da. Conclusively，the HA from plateau zokor’s tissues by this extraction method is of good recovery rate and high purity，and HA in the tissues of plateau zokor is of high molecular weight and high content.

plateau zokor；hyaluronic acid；extraction process；characterization methods

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.022

2016-07-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260512），青海省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014-ZJ-714）

魏琳娜，女，碩士研究生，研究方向：野生動(dòng)植物資源保護(hù)與利用；E-mail：weilinna92@163.com

魏蓮，女，副教授，研究方向：動(dòng)物生理生化；E-mail：weidengbang@163.com