謝文萍 肇慧君 張琳 姜紅旭 吳斌 孫浩

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 1160341；2. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，大連 116001）

LAMP技術(shù)快速診斷布魯氏菌病的研究

謝文萍1肇慧君2張琳2姜紅旭2吳斌2孫浩1

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 1160341；2. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，大連 116001）

旨在應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）對(duì)布魯氏菌進(jìn)行研究。針對(duì)布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計(jì)LAMP引物，通過(guò)濁度法對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用建立好的LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行特異性及靈敏性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：（1）優(yōu)化后的反應(yīng)條件是62℃恒溫60 min，內(nèi)引物1.50 μmol/μL、外引物0.20 μmol/μL、環(huán)引物1.0 μmol/μL。（2）該LAMP方法與3株布魯氏菌均發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，達(dá)到陽(yáng)性濁度值，而與小腸耶爾森（ATCC9510）、大腸桿菌（ATCC25922）、沙門(mén)氏菌（ATCC10708）和金黃色葡萄球菌（ACTT33591）等標(biāo)準(zhǔn)菌株沒(méi)有擴(kuò)增反應(yīng)。（3）濁度法和實(shí)時(shí)熒光法兩種方法的檢測(cè)最低限分別為4.36 fg/μL和436 fg/μL，其靈敏度均高于普通PCR的最低檢出值4.36 pg/μL。LAMP檢測(cè)技術(shù)用于布病臨床診斷具有快速、高效、便捷等特點(diǎn)，對(duì)于基層布病的病原學(xué)診斷具有實(shí)用價(jià)值。

布魯氏菌；16S rDNA；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱(chēng)布病，是由布魯氏菌侵入機(jī)體所引起的一種人畜共患傳染病，人患病途徑一般為接觸已經(jīng)感染的動(dòng)物或者食物，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)乙類(lèi)法定報(bào)告?zhèn)魅静。?，2］。布魯氏菌屬于革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，可以引起動(dòng)物流產(chǎn)、不孕和人的勞動(dòng)力喪失［3-5］。近年來(lái)，布病在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢(shì)，全世界每年報(bào)道的布病病例超過(guò)500萬(wàn)，由于布病給動(dòng)物產(chǎn)品及公共衛(wèi)生安全帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失巨大，因此布病的防治十分嚴(yán)峻［6］。

Notomi等［7］在2000年研發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LA-MP），在65℃條件下，15-60 min DNA 可以擴(kuò)增1010倍左右，反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的形成進(jìn)行肉眼觀察，或者通過(guò)濁度儀檢測(cè)焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來(lái)判定［8-11］。該方法與普通PCR相比，具有高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、結(jié)果易于鑒定等特點(diǎn)，具有更大優(yōu)勢(shì)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已被用于對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)的檢測(cè)和動(dòng)物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域［12-19］，在疾病的快速檢測(cè)方面發(fā)展迅速，可對(duì)多種疾病進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，是比較有發(fā)展前景的快速診斷手段方法之一。本研究針對(duì)布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化 LAMP各反應(yīng)條件，并對(duì)該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

羊種布魯氏菌16M、豬種布魯氏菌S2、牛種布魯氏菌2308三種標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌核酸和小腸耶爾森ATCC9510、大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌ATCC33591、志賀氏菌ATCC29903對(duì)照菌株均來(lái)自于相關(guān)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自廣州迪奧生物科技有限公司；蛋白酶k購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計(jì)LAMP引物，引物序列如表1所示。

表1 布魯氏菌引物序列

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 提取細(xì)菌基因組具體步驟：吸取細(xì)菌培養(yǎng)液200 μL，10 000 r/min離心1 min，棄上清。將沉淀用540 μL TE緩沖液重懸。在重懸液中加入30 μL 10%（W/V）SDS、3 μL 2%（W/V）蛋白酶K?；旌虾?7℃溫育1 h。用等體積的酚氯仿對(duì)裂解細(xì)胞抽提兩次，12 000 r/min離心2 min，取上清。加入兩倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，12 000 r/min離心1 min。沉淀溶解在100 μL的TE緩沖液中，-20℃冰箱保存。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的配制 根據(jù)LAMP反應(yīng)試劑盒推薦的25 μL體系進(jìn)行配制，在超凈臺(tái)上進(jìn)行。

1.2.3.1 染色法反應(yīng)體系為 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 μL，Bst 聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心，將1 μL的顯色液滴在PCR管蓋中央。將上述反應(yīng)管放入63℃的恒溫金屬水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，顛倒PCR管數(shù)次，使反應(yīng)混合液和顯色液充分混勻，觀察反應(yīng)液顏色。根據(jù)顏色變化觀察結(jié)果。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光法反應(yīng)體系 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/ B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 mL，Bst 聚合酶1 μL，熒光染料Ⅰ0.5 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心。使用LC480，選擇FAM通道，反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃15 s；63℃15 s、63℃45 s，共45個(gè)循環(huán)。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)濁度法反應(yīng)體系 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/ B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 μL，Bst 聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心。將反應(yīng)管放入LC-320C濁度儀中，63℃ 60 min。根據(jù)濁度圖判斷結(jié)果。

1.2.4 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化 （1）反應(yīng)時(shí)間：保持DNA擴(kuò)增試劑盒（迪奧生物科技有限公司）的推薦溫度63℃，以5 min為梯度，改變反應(yīng)時(shí)間分別為：65、60、55和50 min、反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增情況，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。（2）反應(yīng)溫度：選擇60、61、62和63℃為不同溫度條件，以最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定布魯氏菌的最佳反應(yīng)溫度。再以得到的反應(yīng)溫度驗(yàn)證其反應(yīng)時(shí)間也具有以上實(shí)驗(yàn)的相似的趨勢(shì)。（3）引物濃度：布魯氏菌的引物分為內(nèi)、外引物和環(huán)引物（表2），兩組均進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。環(huán)引物保持不變，內(nèi)、外引物同時(shí)進(jìn)行梯度變化，同理，環(huán)引物進(jìn)行梯度變化，從而得到最適宜的引物濃度。

表2 內(nèi)、外引物濃度

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 分別以羊種布魯氏菌16M、豬種布魯氏菌S2和牛種布魯氏菌2308、小腸耶爾森ATCC9510、大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌ATCC33591、志賀氏菌ATCC29903的基因組作為模板，進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 測(cè)定牛種布魯氏菌2308核酸的濃度為43.6 ng/μL，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫降臐舛忍荻确謩e為：43.6 ng/μL、4.36 ng/μL、436 pg/μL、43.6 pg/μL、4.36 pg/μL、436 fg/μL、43.6 fg/μL和4.36 fg/μL。分別取1.0 μL作為反應(yīng)模板，使用濁度儀法、實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行LAMP反應(yīng)，同時(shí)與普通PCR方法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別以羊種布魯氏菌16M和牛種布魯氏菌2308作為1號(hào)和2號(hào)DNA模板，3號(hào)以水作為陰性對(duì)照。兩種模板使用染色法進(jìn)行鑒定，發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)則PCR管發(fā)綠色熒光，沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)則為橙紅色（圖1）。采用濁度儀方法，結(jié)果（圖2）顯示濁度達(dá)到0.1以上并且最下方為紅色則為陽(yáng)性，如為綠色則為陰性，即沒(méi)有核酸擴(kuò)增。圖3為實(shí)時(shí)熒光法，出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線則判斷陽(yáng)性，若無(wú)“S”型曲線為陰性。以下3個(gè)結(jié)果圖中，1號(hào)樣品和2號(hào)樣品均具有陽(yáng)性判定特征，即有核酸擴(kuò)增，而3號(hào)樣品則為陰性結(jié)果。與理論分析相符，3種方法均可以檢測(cè)到布魯氏菌。

圖1 布魯氏菌LAMP可視化檢測(cè)

圖2 布魯氏菌LAMP濁度儀檢測(cè)

圖3 布魯氏菌LAMP實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 以布魯氏菌陽(yáng)性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在濁度儀中設(shè)定的4個(gè)反應(yīng)時(shí)間的LAMP試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖4-A與圖4-B樣品的濁度值最高并且?guī)缀跸嗤?，因此可選擇60 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖4 時(shí)間梯度圖

2.2.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以布魯氏菌陽(yáng)性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以6 min為最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)溫度的優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)果如圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5-C）表明，反應(yīng)溫度在62℃時(shí)，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率達(dá)到最高，濁度值最大。以62℃進(jìn)行時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)（圖6），與2.2.1的結(jié)果具有相似的趨勢(shì)，因此62℃可確定為為L(zhǎng)AMP反應(yīng)最適溫度。

圖5 溫度梯度圖

2.2.3 引物濃度的優(yōu)化 以布魯氏菌陽(yáng)性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示，只有3號(hào)樣品得到了陽(yáng)性結(jié)果，也就是說(shuō)當(dāng)體系中內(nèi)引物為1.5 μmol/μL、外引物0.20 μmol/μL時(shí)，才能夠檢測(cè)出布魯氏菌。而作為不影響陰、陽(yáng)性結(jié)果，僅僅增加反應(yīng)效率的環(huán)引物則與樣品濁度表現(xiàn)出線性關(guān)系，如圖8所示，會(huì)隨著環(huán)引物的濃度增加樣品的濁度也隨之增加。因此，環(huán)引物的合適濃度則為1 μmol/μL。

圖6 時(shí)間梯度圖

圖7 內(nèi)、外引物濃度優(yōu)化結(jié)果圖

圖8 環(huán)引物濃度

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

對(duì)3株陽(yáng)性布魯氏菌和5株對(duì)照菌的核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示，3株布魯氏菌反應(yīng)結(jié)果均有擴(kuò)增，為陽(yáng)性結(jié)果，5株陰性對(duì)照菌均為陰性結(jié)果。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP檢測(cè)方法具有較好的特異性。

圖9 布魯氏菌LAMP特異性濁度法檢測(cè)

2.4 靈敏度試驗(yàn)

將10倍梯度稀釋的牛種布魯氏菌2308的核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，圖10為濁度儀中62℃恒溫60min的反應(yīng)結(jié)果，濁度儀的檢測(cè)低限為4.36 fg/μL，并且最后一個(gè)樣品的濁度遠(yuǎn)大于0.1。實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖11）顯示，最低檢測(cè)的樣品濃度約為436 fg/μL。普通PCR靈敏度的檢測(cè)到的最小值為4.36 pg/μL（圖12）。結(jié)果表明濁度儀和熒光定量的靈敏度均高于普通PCR。與普通PCR相比，靈敏度大幅提高，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖10 布魯氏菌LAMP靈敏度濁度法檢測(cè)

圖11 布魯氏菌LAMP靈敏度實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

圖12 布魯氏菌LAMP靈敏度電泳檢測(cè)

3 討論

近年來(lái)，檢測(cè)LAMP反應(yīng)的方法有目視檢查渾濁、染色法、實(shí)時(shí)濁度法和實(shí)時(shí)熒光法［20-23］。目視檢查渾濁是通過(guò)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀進(jìn)行判斷，但是沉淀量較低時(shí)很難直接觀察結(jié)果。染色法則能顯著提高肉眼的識(shí)別率，可直接進(jìn)行陰、陽(yáng)性結(jié)果的判斷。實(shí)時(shí)濁度法和實(shí)時(shí)熒光法則能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但是兩種方法都需要特定的儀器設(shè)備，成本較高。

本研究中對(duì)濁度法進(jìn)行了反應(yīng)條件優(yōu)化，在50-60 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，時(shí)間對(duì)反應(yīng)的結(jié)果影響并不是很大。在進(jìn)行的特異性實(shí)驗(yàn)時(shí)，3株布魯氏菌都顯示有核酸擴(kuò)增，而其他5株陰性對(duì)照菌無(wú)核酸擴(kuò)增，判定為陰性，結(jié)果表明引物具有較高的特異性。LAMP是一種高靈敏度檢測(cè)方法，其靈敏度通常比普通PCR約高100倍。通過(guò)濁度法、實(shí)時(shí)熒光和普通PCR 3種方法進(jìn)行靈敏度分析，分別得到的檢測(cè)極限為4.36 fg/μL、436 fg/μL和4.36 pg/μL，結(jié)果比較后可以得出LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度要高于普通PCR，優(yōu)勢(shì)明顯。圖9中最高濃度的樣品在濁度儀實(shí)驗(yàn)中反而出現(xiàn)了陰性結(jié)果，是否因?yàn)闃悠窛舛冗^(guò)高而影響了濁度儀對(duì)陰陽(yáng)性的判斷，還需要大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

針對(duì)布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計(jì)引物并建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）。通過(guò)3種方法對(duì)布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、速度快且設(shè)備要求簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，但對(duì)于靈敏度而言，濁度儀法相對(duì)具有優(yōu)勢(shì)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Rapid Diagnosis of Brucella by Loop-mediated Isothermal Amplification

XIE Wen-ping1ZHAO Hui-jun2ZHANG Lin2JIANG Hong-xu2WU Bin2SUN Hao1
（1. Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001）

This study aims to apply the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）in detecting Brucella. A set of six specific primers specific to regions of 16S rDNA gene were designed，and the turbidity technique was employed to optimize the reaction conditions，by which the specificity and sensitivity of the method were evaluated. Results are：（1）the optimized temperature was 62℃ at constant 60 min，and the concentration of inner primer was 1.50 μmol/μL，0.20 μmol/μL outer primers，and 1.0 μmol/μL loop primers；（2）furthermore，3 strains of Brucella occurred LAMP amplification reaction and achieved the positive turbidity value，but there was no amplification with other control group including Yersinia enterocolitica ATCC9510，Escherichia coil ATCC25922，Salmonella typhimurium ATCC10708，and Staphylococcus aureus ACTT33591；（3）the minimum thresholds for turbidity technique and real-time fluorescence were 4.36 fg/μL and 436 fg/μL respectively，their sensitivities were both higher than the value by conventional PCR，4.36 pg/μL. Obviously，it is fast，efficient，and convenient while LAMP is applied in the clinic diagnosis of Brucella，therefore，it is practically applicable for the pathogenic diagnosis of Brucella in grassroots communities.

Brucella；16S rDNA；loop-mediated isothermal amplification（LAMP）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.027

2016-09-02

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研項(xiàng)目（2014IK248）

謝文萍，女，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：xwponly@163.com

吳斌，女，博士研究生，研究員，研究方向：食品安全，E-mail：wubin69@163.com；孫浩，男，副教授，研究方向：食品資源開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：cjohns@163.com