李虹儀 李家標(biāo) 鄭藝林 吉盧琳 張茂 鄭恩琴

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊，龍巖 364012；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室，廣州 510642）

miR-124靶向TNF-α促進(jìn)豬皮下脂肪細(xì)胞分化

李虹儀1李家標(biāo)1鄭藝林1吉盧琳1張茂1鄭恩琴2

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊，龍巖 364012；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室，廣州 510642）

前期研究中采用雙螢光素酶報告基因驗證了miR-124與脂解因子豬TNF-α之間的靶關(guān)系，以此為基礎(chǔ)研究miR-124是否影響豬皮下脂肪細(xì)胞的分化。采用miR-124 模擬物mimics和抑制物inhibitor 分別轉(zhuǎn)染豬脂肪前體細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化成成熟脂肪細(xì)胞，檢測細(xì)胞的聚脂情況，甘油及甘油三酯的含量變化，熒光定量檢測脂肪細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-124 能抑制TNF-α蛋白的表達(dá)，脂肪細(xì)胞脂滴多于對照組，甘油三酯（TG）含量顯著增加（P＜0.01），甘油含量亦顯著增加（P＜0.05），PPARγ、FASNT和HSL的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；抑制細(xì)胞miR-124的表達(dá)脂滴則較少，TG含量顯著減少（P＜0.05），PPARγ和FASN的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。miR-124可能通過抑制TNF-α調(diào)節(jié)豬脂肪細(xì)胞的分化，為后續(xù)研究miR-124調(diào)節(jié)脂肪代謝的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

miR-124；豬；脂肪分化；TNF-α

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一個多功能因子，由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，從多方面影響脂肪細(xì)胞的功能。TNF-α在脂肪組織中與多個基因相互聯(lián)系，起著抑制脂肪生成［1］、促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂解［2］等作用。miRNA（microRNA）是近年來逐漸被關(guān)注的調(diào)控分子，能通過靶mRNA的編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合實施轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明miRNA調(diào)控哺乳動物至少60%的基因［3］，參與了幾乎所有細(xì)胞的活動。越來越多的研究結(jié)果顯示，miRNA對脂肪細(xì)胞的分化增殖及脂肪的沉積起至關(guān)重要的作用。如miR-130和miR-27家族均通過減少靶基因PPARγ的生物合成抑制人脂肪細(xì)胞的分化［4，5］；而miR-148則是通過靶向CREB基因非翻譯區(qū)，抑制其表達(dá)從而促進(jìn)人脂肪細(xì)胞的分化［6］。

miR-124目前的研究大都與腫瘤相關(guān)，研究顯示miR-124可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞［7］、胃癌細(xì)胞［8］、乳腺癌細(xì)胞［9］、前列腺癌細(xì)胞［10］等癌癥相關(guān)細(xì)胞的增殖。miR-124調(diào)控脂肪相關(guān)功能的研究較為少見，而豬作為沉積脂肪能力最強(qiáng)的動物之一，其與人類在生理生化方面有很多相似性，且存在著天然的脂肪型和瘦肉型品種，因此被認(rèn)為是研究人類肥胖、糖尿病等脂肪代謝相關(guān)疾病最佳的模式動物。

在前期的研究中我們用雙螢光素酶系統(tǒng)檢測出miR-124與豬TNF-α有直接的靶關(guān)系，能顯著抑制豬TNF-α的表達(dá)［11］。因此，本實驗以豬皮下脂肪前體細(xì)胞為模型，研究miR-124對豬脂肪細(xì)胞分化的影響以及是否通過TNF-α起調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶購自Corning公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、I 型膠原酶、雙抗（青、鏈霉素）購自GIBCO公司；地塞米松（Dexmethasone）、重組牛胰島素（Insulin）、油酸（Oleic acid）和辛酸（Octanoic acid）購自SIGMA公司；油紅O（Oil Red O）、PMSF購自Amresco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol一步法總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；96孔定量PCR板和定量PCR膜購自Axygen；miRNA mimics、inhibitor以及陰性對照（NC）由上海吉瑪公司合成；甘油三酯檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液和BCA法總蛋白測定試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬皮下脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用Zhou等［12］建立的分離培養(yǎng)方法，選取7日齡的長白仔豬，放血處死后用75%（V/V）酒精消毒，在無菌條件下分離背部皮下脂肪，眼科剪將脂肪組織剪碎后用0.1%的I型膠原酶于37℃水浴搖床消化1-2 h。消化液過篩后于800×g離心5 min，在沉淀細(xì)胞中加入10 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育10 min過篩，再用DMEM/F12洗滌細(xì)胞，800×g離心10 min后用含10%新生牛血清、100 000 U/L青霉素，100 mg/L的鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo) 生長良好的脂肪前體細(xì)胞消化后以1.5×105cells/cm2接種到6孔板中，細(xì)胞24 h內(nèi)匯合90%時，將70 ng miR-124 mimics或inhibitor與LipofectamineTM2000進(jìn)行孵育，按照說明書操作方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并以NC作為陰性對照，每個處理設(shè)6個重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h后用含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養(yǎng)基進(jìn)行對細(xì)胞誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d。

1.2.3 油紅O染色 將誘導(dǎo)8 d的脂肪細(xì)胞用DMEM/F12洗兩次，加入200-250 μL 4%多聚甲醛固定液固定后加入油紅O工作液染色30 min；染完用清水沖洗去掉殘留的油紅O，滴加適量甘油封孔，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 甘油及甘油三酯檢測 細(xì)胞誘導(dǎo)過程中收集細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行甘油檢測；誘導(dǎo)8 d后脂肪細(xì)胞用DMEM/F12洗兩次，加入100 μL細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液），輕輕搖動培養(yǎng)板充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到500 μL離心管中，BCA（bicinchoninic acid）法測定每孔細(xì)胞總蛋白含量；甘油和甘油三酯測定分別根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中甘油和甘油三酯的濃度，所得數(shù)據(jù)均用總蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.2.5 Western blot 檢測 提取分化成熟脂肪細(xì)胞的總蛋白，用5%PAGE濃縮膠和10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠對總蛋白進(jìn)行電泳分離，分離完全后將膠上TNF-α蛋白和β-actin分別轉(zhuǎn)到PVDF膜上，1×TBS洗滌膜10 min后用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉后的PVDF膜加入2 mL適度稀釋的蛋白一抗，4℃冰箱旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日移出剩余的一抗，加入2 mL 1∶5 000稀釋的紅外二抗孵育1 h，蛋白顯像用Odyssey紅外成像儀（LI COR）掃描。

1.2.6 定量檢測 Trizol一步法抽取誘導(dǎo)后皮下脂肪細(xì)胞總RNA，OligodT18反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板進(jìn)行各相關(guān)基因的熒光定量PCR檢測，所用引物如下：

PPARγ：S-CATTCGCATCTTTCAGGG，ATGGACGCCATACTTTAGGA；

FASN：S-ACCGAGTGGCTGGGTATT，A-CAAGAAGAGGTTGTTGTGGG；

HSL：S-GCCCGAGACGAGATTAG，ATGAAGGGATTCTTGACG。

檢測結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參照，根據(jù)以下公式計算出目的基因相對于內(nèi)參基因的比值來反應(yīng)各基因mRNA表達(dá)豐度：2-ΔCt＝2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 組間差異采用t檢驗進(jìn)行分析，以P＜0.05作為差異顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)分析均由SPSS19.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 豬皮下脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

豬皮下脂肪前體細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底90%時將培養(yǎng)基更換為含有含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養(yǎng)基，隔天換液，連續(xù)誘導(dǎo)8 d。從顯微鏡下可以觀察到（圖1），誘導(dǎo)2 d后細(xì)胞開始出現(xiàn)黃色小脂滴，此后隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，脂滴的數(shù)量逐漸增多，體積逐漸增大。第8天時可以清楚地觀察到細(xì)胞的形態(tài)以及脂滴在細(xì)胞中的分布，前期出現(xiàn)的脂滴在此時已變得飽滿明亮，周圍擠滿了后期分化的脂滴。

圖1 豬脂肪細(xì)胞分化模型

2.2 miR-124對豬脂肪細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

前期研究工作中得出miR-124能通過種子序列抑制TNF-α的表達(dá)，為了進(jìn)一步研究miR-124是否作用于豬脂肪細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，利用前體細(xì)胞的分化模型，以1.5×105cells/cm2的密度將前體細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿90%時，分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics以及陰性對照NC，轉(zhuǎn)染24 h后將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d后收集細(xì)胞蛋白，Western blot 檢測結(jié)果（圖2）顯示，過表達(dá)miR-124會抑制豬脂肪細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)。

圖2 miR-124抑制TNF-α蛋白表達(dá)

2.3 miR-124對豬皮下脂肪前體細(xì)胞分化的影響

為了研究miR-124對豬皮下脂肪前體細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，待細(xì)胞鋪滿90%時，分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、miR-124 inhibitors和NC，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行分化誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d，收集細(xì)胞檢測各處理細(xì)胞的總蛋白量及TG含量。校正結(jié)果（圖3-A）顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics的細(xì)胞TG含量比對照組顯著增加（P＜0.01），轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor 的細(xì)胞對照組TG含量比對照組顯著降低（P＜0.01）。油紅O對脂肪細(xì)胞染色結(jié)果與TG檢測結(jié)果一致。從圖3-B和3-C可以看出，過表達(dá)miR-124時細(xì)胞脂滴增多，抑制則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。同時，又對細(xì)胞的甘油含量進(jìn)行了檢測（圖3-C），發(fā)現(xiàn)表過達(dá)miR-124的細(xì)胞甘油含量也顯著增加（P＜0.05）。

圖3 miR-124調(diào)控脂肪細(xì)胞的聚酯分化

2.4 miR-124對脂肪前體基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

為了驗證miR-124是否通過TNF-α影響脂肪細(xì)胞的分化，收集誘導(dǎo)8 d的脂肪細(xì)胞進(jìn)行RNA抽取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量檢測與TNF-α相互調(diào)節(jié)且對脂肪細(xì)胞分化起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子和酶的表達(dá)，結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics的細(xì)胞PPARγ、FASN和HSL的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01），而抑制miR-124表達(dá)的細(xì)胞PPARγ和FASN的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），而HSL則同樣顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖4 miR-124調(diào)控脂肪細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

本研究以豬皮下脂肪前體細(xì)胞為模型進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分化過程中可見細(xì)胞內(nèi)的脂滴隨著分化天數(shù)的增加不斷變多、變大，且能被油紅O所染色，說明豬皮下脂肪細(xì)胞培養(yǎng)成功，保證后續(xù)實驗的開展。在前期實驗中發(fā)現(xiàn)miR-124能抑制豬TNF-α的表達(dá)，而TNF-α在脂肪細(xì)胞中能夠通過NIK-TAK1/TAB1軸激活NFκB對PPARγ進(jìn)行抑制［13］，從而起到一定的脂解作用。本研究中細(xì)胞過表達(dá)miR-124后表現(xiàn)為TNF-α蛋白含量減少，脂滴增多，甘油三酯含量顯著增加，可能為細(xì)胞分化過程中miR-124通過抑制TNF-α的表達(dá)減緩對PPARγ的抑制，使細(xì)胞表現(xiàn)為促進(jìn)脂肪合成。定量檢測中顯示PPARγ和FASN的表達(dá)顯著上升，其中PPARγ是脂肪前體細(xì)胞分化中后期兩個最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，而FASN在脂肪酸合成中起著至關(guān)重要的作用，影響著動物脂肪的沉積。定量的結(jié)果正好印證了上述推測觀點(diǎn)。

過多的的脂肪將通過脂肪動員，在HSL的刺激下分解成甘油和游離的脂肪酸，但是，細(xì)胞上清甘油的含量和細(xì)胞HSL的表達(dá)并不如預(yù)測中般下降，而是上升。有研究也顯示，TNF-α能夠抑制HSL mRNA表達(dá)［14］，因此，本研究中過表達(dá)miR-124提高HSL基因表達(dá)可能是通過抑制TNF-α的表達(dá)來完成的，且對應(yīng)地表現(xiàn)為細(xì)胞甘油含量顯著增加。豬脂肪細(xì)胞的合成與分解途徑是相互協(xié)調(diào)的［15］，因此推測實驗中過表達(dá)miR-124使脂肪細(xì)胞合成代謝加快，TG含量顯著增加，但細(xì)胞為了維持代謝平衡，提高內(nèi)部分解代謝酶的表達(dá)，一定程度上促進(jìn)了脂肪的分解，因此甘油含量比對照組高。即過表達(dá)miR-124同時促進(jìn)了脂肪的合成代謝與分解代謝，合成代謝速度比分解代謝快使細(xì)胞表現(xiàn)為脂滴增多。

另外，實驗還研究了抑制miR-124的表達(dá)細(xì)胞TNF-α蛋白水平和脂滴的變化，TG和甘油含量變化以及相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，細(xì)胞的聚酯情況，TG含量，PPARγ和FASN的表達(dá)均表現(xiàn)為與miR-124 mimics相反的作用，但TNF-α的蛋白水平及甘油含量均沒顯著變化，而HSL表達(dá)雖然不及mimics般顯著但同樣表現(xiàn)為上升，這可能為多個小RNA同時作用于相同靶基因，抑制之后其他小RNA會有一定的補(bǔ)償效應(yīng)。

4 結(jié)論

miR-124能通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，過表達(dá)miR-124將促進(jìn)細(xì)胞的聚酯，提高TG的含量，提高相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-124的表達(dá)則結(jié)果相反。

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（責(zé)任編輯 李楠）

miR-124 Regulates Porcine Adipocyte Differentiation Trough Targeting TNF-α

LI Hong-yi1LI Jia-biao1ZHENG Yi-lin1JI Lu-lin1ZHANG Mao1ZHENG En-qin2
（1.Animal Nutrition Scientific Research Innovation Team，College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012；2.Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding， South China Agricultural University， Guangzhou 510642）

In the previous research，porcine TNF-α was found to be the target of miR-124 by dual luciferase assay. Here we verify whether miR-124 has the effect on the differentiation of porcine adipocyte. Porcine pre-adipocyte was transfected with miR-124 mimics or inhibitor to over-express or to repress miR-124，and then induced into mature adipocytes. The accumulation of lipid droplets was observed using Oil Red O staining and the amount of glycerol and triglycerides（TG）were detected by TG assay and glycerol assay. The expressions of PPARγ（proliferator-activated receptor-γ），F(xiàn)ASN（fatty acid synthase），and HSL（hormone-sensitive lipase）were detected by real time fluorescence quantitative PCR. The result showed that overexpression of miR-124 repressed the expression of TNF-α protein，therefore，lipid droplets were more than that in the control，TG increased significantly（P ＜ 0.01），also the same for glycerol（P ＜ 0.05），and the expressions of PPARγ，F(xiàn)ASNT，and HSL significantly up-regulated（P ＜ 0.01）. Repressing miR-124 resulted in the reduction of lipid droplets and the significant decrease of TG，and the expressions of PPARγ and FASNT significantly down-regulated（P ＜ 0.05）. In conclusion，miR-124 might regulate the differentiation of porcine adipocyte by suppressing TNF-α，laying a foundation for future studies on the mechanism of miR-124 regulating lipid metabolism.

miR-124；porcine；adipocyte differentiation；TNF-α

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.025

2016-08-02

福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201511312055），福建省自然科學(xué)基金項目（2014J05043），龍巖學(xué)院博士啟動基金項目（LB2013012）

李虹儀，女，講師，研究方向：動物營養(yǎng)生理與生物化學(xué)；E-mail：politician_137@163.com

張茂，男，講師，研究方向：動物遺傳；E-mail：zm18email@163.com