張世偉 陳曦 鐘其頂 黃占斌 孟鎮(zhèn) 羅金學(xué) 石玲 白志輝

（1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；4. 中糧長(zhǎng)城桑干酒莊（懷來(lái)）有限公司，張家口 075400）

不同品種釀酒葡萄表皮微生物群落多樣性分析

張世偉1，2，3陳曦3鐘其頂2黃占斌1孟鎮(zhèn)2羅金學(xué)3石玲4白志輝3

（1. 中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；4. 中糧長(zhǎng)城桑干酒莊（懷來(lái)）有限公司，張家口 075400）

葡萄酒釀造是多種微生物參與代謝的過(guò)程，其中的微生物在沒(méi)有外源接種的情況下通常認(rèn)為源自釀酒葡萄本身。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，分析沙城地區(qū)不同品種釀酒葡萄表皮的微生物群落，旨在從源頭上了解葡萄酒釀造原料的品質(zhì)，為研究釀酒葡萄微生物對(duì)釀酒品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，無(wú)論細(xì)菌還是真菌豐富度最大的均為雷司令，細(xì)菌主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等8個(gè)門，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要是歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等6個(gè)屬。真菌僅分布在子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）3個(gè)門，鏈格孢菌屬（Alternaria）、枝孢屬（Cladosporium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、鐮孢屬（Fusarium）等9個(gè)主要的屬。細(xì)菌中心OTU最相似菌種分別為節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）等，真菌為枝孢菌（Cladosporium sp.）、莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）以及大量未知種屬的OTU。研究表明，葡萄品種是影響微生物群落的最重要的因素，推測(cè)釀酒葡萄上的一些微生物會(huì)對(duì)葡萄植株的健康、葡萄果實(shí)的品質(zhì)以及葡萄酒釀造產(chǎn)生有益或有害的影響。

釀酒葡萄；高通量測(cè)序；微生物群落；葡萄酒品質(zhì)；細(xì)菌多樣性；真菌多樣性

葡萄酒釀造過(guò)程的本質(zhì)是從葡萄收集、破碎成汁、葡萄酒一次、二次發(fā)酵直到包裝、儲(chǔ)藏整個(gè)工藝中多種微生物參與代謝的過(guò)程。新鮮采摘釀酒葡萄上的微生物數(shù)量大約為107-108CFU/g（葡萄鮮重），這些微生物會(huì)對(duì)后續(xù)的葡萄酒發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生重要影響［1］。Leveau等［2］通過(guò)焦磷酸測(cè)序方法研究美國(guó)加利福尼亞Clarksburg地區(qū)的釀酒葡萄發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌屬（Pseudomonas）是霞多麗葡萄主要的細(xì)菌類群。Bokulich等［3］通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序方法研究了美國(guó)加利福尼亞兩個(gè)不同地區(qū)霞多麗、赤霞珠、仙粉黛釀酒葡萄汁中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)其中的葡糖桿菌屬（Gluconobacter）等在葡萄酒釀造過(guò)程中能夠促進(jìn)酯類物質(zhì)的生成，改善葡萄酒的感官，而乳桿菌屬（Lactorbacillus）則會(huì)導(dǎo)致葡萄酒產(chǎn)生異味。Martin等［4］通過(guò)T-RFLP技術(shù)研究了法國(guó)Lussac St. Emilion地區(qū)不同葡萄園中美樂(lè)葡萄上的附生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞桿菌屬（Pseudomonas）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas），其中的假單胞桿菌屬（Pseudomonas）是葡萄中普遍存在的細(xì)菌類群；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄園土壤中的微生物和葡萄上的微生物存在聯(lián)系，因此推測(cè)植物不同器官上的附生菌可能有著共同的來(lái)源。迄今為止，雖已有少量有關(guān)釀酒葡萄微生物的報(bào)道，但對(duì)其群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、對(duì)后續(xù)葡萄酒發(fā)酵的影響等仍然知之甚少。因此，探明不同品種釀酒葡萄微生物群落結(jié)構(gòu)，從源頭上了解葡萄酒釀造原料的品質(zhì)，對(duì)于保證葡萄酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

沙城地區(qū)多丘陵山地，土壤為褐土，光照充足，晝夜溫差大，干燥少雨，是釀酒葡萄種植最為理想的黃金地帶。目前，沙城地區(qū)種植著幾十個(gè)品種的釀酒葡萄，幾乎涵蓋了我國(guó)釀酒葡萄的全部品種，是我國(guó)優(yōu)質(zhì)葡萄酒的主要產(chǎn)區(qū)之一。本研究應(yīng)用Illumina平臺(tái)的Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)，分析了沙城地區(qū)不同品種釀酒葡萄表面的細(xì)菌、真菌群落組成、結(jié)構(gòu)以及多樣性，旨在為研究不同品種釀酒葡萄微生物對(duì)釀酒品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地概況 采樣樣地位于河北省懷來(lái)縣沙城鎮(zhèn)某釀酒葡萄園內(nèi)，該地區(qū)位于北緯40°4'-40°35'，東經(jīng)115°16'-115°58'，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，雨熱同期，光照充足，日照率68%，年均氣溫9.1℃，白天太陽(yáng)輻射強(qiáng)，夜間地面散熱快，晝夜溫差大，5-9月是農(nóng)作物生長(zhǎng)季節(jié)，期間晝夜溫差可達(dá)11℃-12.4℃。樣地屬于規(guī)?；劸破咸褕@，葡萄樹齡最短的為10年，最長(zhǎng)的為37年。

1.1.2 樣品采集 分別采集霞多麗（Chardonnay，Cha）、 雷 司 令（Riesling，Rie）、 黑 品 諾（Pinot nior，Pin）、寶石（Gem，Gem）、赤霞珠（Cabernet Sauvignon，Cab）、增芳德（Zinfandel，Zin）、龍眼（Longan，Lon）、西拉（Syrah，Syr）、美樂(lè)（Merlot，Mer）共9個(gè)品種的釀酒葡萄果實(shí)。釀酒葡萄樣品用經(jīng)75%酒精消毒后的剪刀采集新鮮、飽滿、無(wú)病害的果實(shí)，置于無(wú)菌自封袋中，再將裝有葡萄樣品的自封袋置于低溫采樣箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍備用。每個(gè)品種釀酒葡萄樣品采集均按照“五點(diǎn)取樣法”收集5個(gè)植株的果實(shí)，混合后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。部分品種釀酒葡萄發(fā)酵制成葡萄酒的理化指標(biāo)如表1所示，均采用GB/15038-2006方法測(cè)定。其中龍眼是我國(guó)特有的葡萄品種，和其他釀酒葡萄品種相比，其含糖量較高，既可作為釀酒葡萄，釀造半甜型葡萄酒，也可作為鮮食葡萄。

表1 不同品種釀酒葡萄發(fā)酵制成葡萄酒的理化指標(biāo)

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 每個(gè)釀酒葡萄品種果實(shí)樣品稱取約30 g，加入100 mL PBS（0.1 mol/L，pH7.0）緩沖液，180 r/min渦旋震蕩30 min，超聲15 min，0.22 μm微孔濾膜（Millipore，USA）抽濾，濾膜剪碎放入滅菌離心管中，用DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP）提取總DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀（Nano Drop，Thermo fisher）檢測(cè)其濃度和純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)引物799F（5'-AACGGATTAGATACCG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）［5］， 以及真菌ITS1區(qū)引物（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和（5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3'）［4］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系如下：DNA模板1 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTPs（2.5 μmol/L）4 μL，10×Pyrobest Buffer 5 μL，Pyrobest DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 35.7 μL。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將同一樣品3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混勻后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，再用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN，USA）切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物用Qubit（Life Technology，USA）進(jìn)行定量化和均一化，用Illumina建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并用Agilent 2100 （Agilent，USA）檢測(cè)文庫(kù)片段分布，將構(gòu)建好的合格文庫(kù)送至北京新科開源基因有限公司進(jìn)行測(cè)序（Hiseq 2500，PE250）。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

1.2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU劃分 將下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，刪除含有連續(xù)＞5 bp的Q值＜15的低質(zhì)量堿基及含有接頭序列的測(cè)序數(shù)據(jù)。然后，根據(jù)barcode標(biāo)簽提取每個(gè)樣本序列數(shù)據(jù)，用軟件Mothur（version 1.36.1）［6］進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗及操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）劃分，OTU序列相似度設(shè)為97%，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品含有OTU的數(shù)目以及每個(gè)OTU含有序列的條數(shù)，以每個(gè)OTU中重復(fù)條數(shù)最多的序列作為每個(gè)OTU的代表序列［7］。

1.2.3.2 豐富度和多樣性分析 選擇在序列97%相似度閾值下繪制稀釋曲線（rarefaction curve），稀釋曲線反映了樣品的取樣深度，可以用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序數(shù)量是否足以覆蓋所有類群。計(jì)算豐富度指數(shù)Chao 1和ACE，二者反映樣品的豐富度，數(shù)值越高說(shuō)明群落物種的豐富度越高。計(jì)算多樣性指數(shù) Shannon和Simpson，二者反映樣品的多樣性程度，Shannon數(shù)值越高說(shuō)明群落物種的多樣性越高，Simpson則相反，數(shù)值越高說(shuō)明群落物種的多樣性越低［8-10］。

1.2.3.3 物種信息注釋 為得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP算法對(duì)97%閾值的OTU代表序列進(jìn)行物種注釋。用數(shù)據(jù)庫(kù)Silva（Release115 http://www.arb-silva.de） 和Unite（https://unite.ut.ee/）分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行比對(duì)，在門（Phylum）和屬（Genus）的水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成，為了得到主要菌群信息，規(guī)定細(xì)菌門的水平上選取相對(duì)豐度大于0.5%的門，屬的水平上選取相對(duì)豐度大于1%的屬；真菌門的水平上菌群分類較少，不設(shè)定閾值，屬的水平上選取相對(duì)豐度大于1%的屬。提取序列數(shù)占序列總數(shù)1%以上的OTU為中心OTU，在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)。其他數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)均采用軟件R 3.0和Origin 9.0。

2 結(jié)果

2.1 有效序列及OTU統(tǒng)計(jì)

對(duì)9個(gè)釀酒葡萄品種果實(shí)表面的細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)以及真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，過(guò)濾掉原始數(shù)據(jù)中的低和霞多麗的真菌測(cè)序量不足，舍棄，其余 8個(gè)細(xì)菌樣品共得到154 612條有效序列，在質(zhì)量序列，去除線粒體DNA、葉綠體DNA以及嵌合體等，其中葡萄品種西拉的細(xì)菌測(cè)序量97%相似度下劃分OTU，共得到1 897個(gè)OTU；8個(gè)真菌樣品共得到714 707條有效序列，在97%相似度下將其聚為不同的OTU，共得到1 313個(gè)OTU。

2.2 豐富度和多樣性分析

如圖1所示，相似度在97%條件下不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)和真菌ITS1區(qū)的稀釋曲線，當(dāng)細(xì)菌OTU數(shù)量達(dá)到600個(gè)左右，真菌OTU數(shù)量達(dá)到300個(gè)左右時(shí)，曲線開始趨于平緩，說(shuō)明本研究中樣品的取樣深度足夠，測(cè)序數(shù)量足以覆蓋所有類群。

圖1 97%相似度條件下的稀釋曲線

如表2所示，不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)樣本的測(cè)序深度指數(shù)coverage均較高（最低的為龍眼94.87%），說(shuō)明此次測(cè)序能夠覆蓋樣本中絕大多數(shù)的微生物信息，可以代表樣本的真實(shí)情況。不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌的豐富度指數(shù)Chao1和ACE最大的為雷司令，最小的為赤霞珠，說(shuō)明這8種釀酒葡萄表面雷司令細(xì)菌群落最豐富，赤霞珠則最稀少。細(xì)菌的多樣性指數(shù)Shannon最大的為霞多麗，最小的為赤霞珠，Simpson指數(shù)則基本相反，說(shuō)明這8種釀酒葡萄表面霞多麗細(xì)菌群落多樣性最高，赤霞珠最低。

如表3所示，不同品種釀酒葡萄表面真菌ITS1區(qū)測(cè)序深度指數(shù)coverage更高，即使是最低的龍眼也可達(dá)99.23%，表明此次測(cè)序數(shù)據(jù)量可以代表樣本的真實(shí)情況。不同品種釀酒葡萄表面真菌的豐富度指數(shù)Chao 1和ACE最大的均為雷司令，Chao1指數(shù)最小的為龍眼，ACE指數(shù)最小的為寶石，龍眼也較小，Chao1和ACE基本一致，說(shuō)明這8種釀酒葡萄表面雷司令真菌群落最豐富，龍眼和寶石則最稀少。真菌的多樣性指數(shù)Shannon最大的為增芳德，最小的為美樂(lè)，Simpson指數(shù)則基本相反，說(shuō)明這8種釀酒葡萄表面增芳德真菌群落多樣性最高，美樂(lè)最低。

表2 不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)測(cè)序深度、豐富度及多樣性指數(shù)

表3 不同品種釀酒葡萄表面真菌ITS1區(qū)測(cè)序深度、豐富度及多樣性指數(shù)

2.3 細(xì)菌和真菌類群分析

在門的分類水平上，不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌除未被分類（unclassfied）類群外，主要分布在8個(gè)已知的門（圖2-A）：變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬 桿 菌 門（Bacteroidetes）、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、醋桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和Thermi。在這8個(gè)門的細(xì)菌中，占比最高的是變形菌門（Proteobacteria），可占霞多麗總細(xì)菌的75.30%，占比最低的黑品諾也可達(dá)31.30%。在屬的分類水平上，不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌主要分布在6個(gè)屬（圖2-B）：歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）、Kaistobacter和小雙孢菌屬（Microbispora）。在這6個(gè)屬的細(xì)菌中，占比最高的是歐文氏菌屬（Erwinia），可占赤霞珠總細(xì)菌的46.20%，占比最低的黑品諾則僅為4.20%。

如圖2-C所示，不同品種釀酒葡萄表面真菌多樣性較少，僅分布在3個(gè)門：子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。在這3個(gè)門的真菌中，占比最高的是子囊菌門（Ascomycota），可占雷司令總真菌的92.50%，占比最低的寶石也可達(dá)89.38%。占比最低的是接合菌門（Zygomycota），僅占龍眼總真菌的1.43%，增芳德則低達(dá)0.63%。如圖2-D所示，不同品種釀酒葡萄表面真菌主要分布在9個(gè)屬（排序不分先后）：鏈格孢菌屬（Alternaria）、枝孢屬（Cladosporium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、鐮孢屬（Fusarium）、耐冷酵母屬（Guehomyces）、孢霉屬（Mortierella）、隱球菌屬（Cryptococcus）、黑附球菌屬（Epicoccum）和漆斑霉屬（Myrothecium）。在這9個(gè)屬的真菌中，占比最高的是鏈格孢菌屬（Alternaria），可占黑品諾總真菌的46.24%，占比最低的霞多麗也可達(dá)20.57%。

圖2 不同品種釀酒葡萄表面微生物在門和屬水平上的比較

2.4 中心OTU及最相似序列分析

如表4所示，對(duì)于不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌提取序列數(shù)占序列總數(shù)1%以上的OTU為中心OTU，得到16個(gè)相對(duì)豐度較高的OTU。細(xì)菌中心OTU所含序列數(shù)占序列總數(shù)比例最高的是赤霞珠（69.02%），最低的是霞多麗（43.13%）。將這些OTU的代表序列在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)得到的最相似菌種分別為節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.， OTU4、OTU7和OTU9）、假單胞菌（Pseudomonas sp.，OTU1和OTU10）、芽孢桿菌（Bacillus sp.，OTU2）、動(dòng)性球菌（Planococcus sp.，OTU5）、泛生菌（Pantoea sp.，OTU6）、短小桿菌（Curtobacterium sp.，OTU8）、纖維菌（Cellulomonas sp.，OTU11）、柄桿菌（Caulobacter sp.，OTU12）、迪茨氏菌（Dietzia sp.，OTU-21）、Uncultured malikia sp.（OTU22）、甲基桿菌（Methylobacterium sp.，OTU37）、根瘤菌（Mesorhizobium sp.，OTU47）和未知種屬的放線菌（OTU23）。

表4 不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌中心OTU及最相似序列

如表5所示，對(duì)于不同品種釀酒葡萄表面真菌提取序列數(shù)占序列總數(shù)1%以上的OTU為中心OTU，得到21個(gè)相對(duì)豐度較高的真菌OTU，真菌中心OTU所含序列數(shù)占序列總數(shù)的比例均在80%以上。將這些OTU的代表序列在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對(duì)得到最相似菌種分別為枝孢菌（Cladosporium sp.，OTU2、OTU5、OTU6和OTU9）、莖點(diǎn)霉（Phoma sp.，OTU3、OTU7和OTU37）、鏈格孢菌（Alternaria sp.，OTU1和OTU4）、Gibberia sp.（OTU8）、 鐮 孢菌（Fusarium sp.，OTU14）、黑附球菌（Epicoccum sp.，OTU15）、隱球菌（Cryptococcus sp.，OTU17）、小 穴 殼 菌（Dothioraceae sp.，OTU33）、Plesporales sp.（OTU55）、Kwoniella sp.（OTU82） 和 未 知 種屬 的OTU（OTU10、OTU11、OTU16、OTU18和OTU23）。

表5 不同品種釀酒葡萄表面真菌中心OTU及最相似序列

3 討論

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)是分析微生物群落的重要工具

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新一代高通量測(cè)序技術(shù)憑借其通量高、速度快、成本低等特點(diǎn)為研究微生物多樣性提供了新的技術(shù)平臺(tái)。本研究采用Illumina平臺(tái)的Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同品種釀酒葡萄表面細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果顯示8個(gè)細(xì)菌樣品共得到154 612條有效序列，最少的為龍眼，有5 191條，最多的為霞多麗，有24 995條；8個(gè)真菌樣品共得到 714 707條有效序列，最少的為龍眼，有17 466條，最多的為梅璐哲，有152 569條。采用細(xì)菌16S rRNA基因V5-V7區(qū)引物（799F和1193R）是為了在擴(kuò)增過(guò)程中避免線粒體DNA和葉綠體DNA的干擾，這樣雖然避免了植物來(lái)源物種信息的干擾，但是也無(wú)法捕捉到藍(lán)細(xì)菌等的物種信息；而且，實(shí)際上，引物799F僅能和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中62%的序列匹配［11］，因此，本研究中細(xì)菌的有效序列條數(shù)（154 612條）較真菌（714 707條）低。在97%相似度下將其聚為不同的OTU，細(xì)菌共得到1 897個(gè)OTU，真菌共得到1 313個(gè)OTU。各樣品的覆蓋度（coverage）結(jié)果顯示在相似度為97%的條件下，OTU涵蓋了釀酒葡萄表面94%以上的細(xì)菌和真菌。以上結(jié)果說(shuō)明此次測(cè)序能夠覆蓋樣本中絕大多數(shù)的微生物信息，可以代表樣本的真實(shí)情況。因此，高通量測(cè)序技術(shù)是分析釀酒葡萄微生物群落的有力工具。

高通量測(cè)序技術(shù)較傳統(tǒng)的分子生物學(xué)手段（如聚丙烯酰胺凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、克隆文庫(kù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）和熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等以及磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）等技術(shù)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。例如，Redford等［12-14］通過(guò)DGGE技術(shù)研究棉白楊葉際微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的可視條帶僅為幾十條，很難反映葉際微生物群落的全貌，而用高通量測(cè)序技術(shù)每個(gè)樣品能夠得到上萬(wàn)條序列，其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)DGGE，可以得到更為全面的微生物群落信息。T-RFLP技術(shù)可通過(guò)和已有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得所擴(kuò)增片段的系統(tǒng)進(jìn)化信息，如Berg等［15］利用此技術(shù)研究了馬鈴薯抵抗植物病原真菌的附生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，但是該技術(shù)對(duì)微生物種屬的定性判斷存在一定誤差。PLFA技術(shù)可通過(guò)不同微生物含有不同種類和數(shù)量的PLFAs對(duì)微生物進(jìn)行分析，如Zhang等［16，17］利用此技術(shù)研究了氯氰菊酯殺蟲劑對(duì)辣椒和黃瓜葉際微生物群落的影響，但是該技術(shù)僅能檢測(cè)到葉際中活體微生物群落的動(dòng)態(tài)變化?？梢?，高通量測(cè)序技術(shù)較傳統(tǒng)的非培養(yǎng)方法可以得到更為全面、準(zhǔn)確、豐富的微生物群落信息。

高通量測(cè)序技術(shù)因其突出的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在蔬菜、水果等植物表面微生物群落研究中得以應(yīng)用。例如，2010年，Lopez-Velasco等［18］將焦磷酸測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于菠菜葉際細(xì)菌16S rRNA 基因多樣性的研究，在新鮮菠菜葉際發(fā)現(xiàn)了8 800個(gè)獨(dú)有的序列，其中75%是以前從未報(bào)道過(guò)的。2012年，Bokulich等［19］通過(guò)焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究了貴腐葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)的動(dòng)態(tài)變化，從發(fā)酵結(jié)束的酒泥中分離出α-變形菌（Alphaproteobacteria）兩個(gè)種的細(xì)菌，揭示了低豐度微生物群落的多樣性，這些結(jié)果表明貴腐葡萄酒較之前的認(rèn)識(shí)更為復(fù)雜，同時(shí)為監(jiān)測(cè)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化奠定了基礎(chǔ)。2013年，Leff等［20］通過(guò)焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)不同品種新鮮水果和蔬菜表面細(xì)菌16S rRNA基因V5-V6區(qū)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果、桃、葡萄以及蘑菇表面主要的細(xì)菌類群為放線菌門（Actinobacteria）、芽孢桿菌門（Bacillus）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。如今，高通量測(cè)序技術(shù)仍然在不斷改進(jìn)，必將推動(dòng)著微生物生態(tài)學(xué)研究更加迅猛的發(fā)展。

3.2 不同品種釀酒葡萄優(yōu)勢(shì)菌群存在差異

本研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄表面細(xì)菌在門的水平上最優(yōu)勢(shì)的類群是變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）。Leveau等［2］通過(guò)焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)霞多麗葡萄上53.5%的細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria），其他主要有厚壁菌門（Firmicutes，15.1%），擬桿菌門（Bacteroidetes，10.1%）和放線菌門（Actinobacteria，8.0%）。Martin等［4］通過(guò)T-RFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)美樂(lè)葡萄上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌也主要?dú)w屬于變形菌門（Proteobacteria），本研究結(jié)果與上述結(jié)果基本一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄表面細(xì)菌在屬的水平上最優(yōu)勢(shì)的類群是歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）。Leveau等［2］發(fā)現(xiàn)霞多麗葡萄上的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）。Martin等發(fā)現(xiàn)美樂(lè)葡萄上的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomona）。本研究結(jié)果與這些結(jié)果具有相似之處，只是本研究發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌屬（Sphingomona）并不是沙城地區(qū)美樂(lè)葡萄的優(yōu)勢(shì)菌屬。在真菌方面，有關(guān)葡萄品種和葡萄表面真菌之間關(guān)系的研究較少［20-23］，Bokulish等［4，19］研究發(fā)現(xiàn)增芳德葡萄表面上的優(yōu)勢(shì)真菌菌屬為C. zemplinina，C. zemplinina能夠增強(qiáng)葡萄酒的感官品質(zhì)，但是本研究發(fā)現(xiàn)增芳德主要的真菌菌屬為鏈格孢菌屬（Alternaria），這與前人研究結(jié)果差異較大。造成本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致的原因可能是多方面的，如葡萄產(chǎn)地、環(huán)境以及采樣時(shí)間等，Martin等［24］的采樣時(shí)間是在秋季葡萄成熟期，本研究采樣的時(shí)間是在七月葡萄生長(zhǎng)旺盛期，此時(shí)正處于葡萄漿果著色的轉(zhuǎn)色期，這個(gè)時(shí)期，漿果已不再膨大，果皮中的葉綠素大量分解，紅葡萄品種果皮開始積累色素，基本轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色和深藍(lán)色，而白葡萄品種透明，漿果含糖量直線上升，這個(gè)時(shí)期基本是大部分葡萄品種含酸量下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄表面微生物的優(yōu)勢(shì)類群因葡萄品種不同存在較大差異。無(wú)論是細(xì)菌還是真菌在門的水平上差異相對(duì)較小，尤其是真菌，3個(gè)優(yōu)勢(shì)門的真菌可占雷司令總真菌的92.50%，占比最低的寶石也可達(dá)89.38%，但在屬的水平上差異較大。在細(xì)菌屬的水平上，霞多麗上的歐文氏菌屬（Erwinia）可占細(xì)菌總數(shù)的46.20%，而雷司令僅為4.30%；雷司令上假單胞菌屬（Pseudomonas）為10.17%，黑品諾僅為3.03%；黑品諾上的芽孢桿菌屬（Bacillus）為19.96%，赤霞珠僅為1.43%；西拉上的丙酸桿菌屬（Propionibacterium）為16.39%，赤霞珠僅為0.03%。在真菌屬的水平上，龍眼上的鏈格孢菌屬（Alternaria）可占真菌總數(shù)的39.40%，最少的霞多麗也占到20.57%；龍眼上的枝孢屬（Cladosporium）為24.14%，而西拉僅為6.74%；赤霞珠上的莖點(diǎn)霉屬（Phoma）為30.62%，而雷司令僅為0.64%；增芳德中的隱球菌屬（Cryptococcus）為1.17%，霞多麗僅為0.29%。由此可見，釀酒葡萄表皮微生物群落因葡萄品種不同差異較大，葡萄品種是影響微生物群落的最重要的因素。

3.3 微生物群落及其對(duì)葡萄酒釀造的影響

研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中心OTU結(jié)果顯示釀酒葡萄表面假單胞菌（Pseudomonas sp.）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）含量較多，這兩種細(xì)菌是自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在的類群，其中的假單胞菌能夠產(chǎn)生胞外多糖，有利于微生物膜（biofilm）的形成，對(duì)于微生物在葡萄表面定殖有著重要的作用。細(xì)菌中心OTU結(jié)果還顯示葡萄表面還有較多短小桿菌（Curtobacterium sp.）和根瘤菌（Mesorhizobium sp.），有研究表明短小桿菌（Curtobacterium sp.）分泌物對(duì)葡萄酒品質(zhì)無(wú)明顯影響［24］，而根瘤菌（Mesorhizobium sp.）具有固氮的獨(dú)特作用，能夠促進(jìn)葡萄樹的生長(zhǎng)［25］。

真菌中心OTU結(jié)果顯示釀酒葡萄表面含有較多鏈格孢菌（Alternaria sp.），有研究表明其可產(chǎn)生鏈格孢醇、鏈格孢醇單甲醚、鏈孢菌酮酸等70多種有毒的真菌代謝物從而引發(fā)葡萄黑斑病，人及動(dòng)物攝入這些真菌毒素可導(dǎo)致急性或慢性中毒，有些還有致癌、致畸、致突變等的作用［26，27］。鏈格孢菌（Alternaria sp.）在其他水果如蘋果、西紅柿、藍(lán)莓以及谷物微生物研究中也有報(bào)道［28］。真菌中心OTU結(jié)果還顯示葡萄表面還有較多枝孢菌（Cladosporium sp.）、莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）和隱球菌（Cryptococcus sp.），枝孢菌（Cladosporium sp.）是環(huán)境中廣泛存在的絲狀真菌，莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）和隱球菌（Cryptococcus sp.）通常主要來(lái)源于葡萄園。枝孢菌（Cladosporium sp.）和莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）可使葡萄腐爛而產(chǎn)生毒素，會(huì)造成葡萄中化學(xué)成分改變并且在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中可影響釀酒酵母的生長(zhǎng)繁殖。隱球菌（Cryptococcus sp.）可產(chǎn)生果膠酶，提高葡萄酒釀造過(guò)程中的出汁率［29-31］。葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物在沒(méi)有外源接種的情況下通常認(rèn)為源自釀酒葡萄本身［32］。生長(zhǎng)在葡萄上的霉菌產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物（如真菌毒素赭曲霉素A）會(huì)干擾葡萄的微生物生態(tài)環(huán)境，從而影響葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母的生長(zhǎng)，改變酒的風(fēng)味［33，34］。真菌還能夠在葡萄表面創(chuàng)造一種有利于醋酸菌生長(zhǎng)的環(huán)境，產(chǎn)生酸性物質(zhì)（如醋酸等），從而改變葡萄汁和葡萄酒的pH，并且產(chǎn)生酸味，對(duì)葡萄酒的感官、生化和微生物的穩(wěn)定性有直接影響［35-37］，甚至?xí)?dǎo)致酒的腐敗變質(zhì)［38］。

4 結(jié)論

不同品種釀酒葡萄表皮微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯，微生物豐度最大的為雷司令，細(xì)菌主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等8個(gè)門，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要分布在歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等6個(gè)屬。真菌僅分布在子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）3個(gè)門，鏈格孢菌屬（Alternaria）、枝孢屬（Cladosporium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、鐮孢屬（Fusarium）等9個(gè)屬。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Microbial Communities on the Wine Grape Surfaces of Different Cultivars

ZHANG Shi-wei1，2，3CHEN Xi3ZHONG Qi-ding2HUANG Zhan-bin1MENG Zhen2LUO Jin-xue3SHI Ling4BAI Zhi-hui3
（1. School of Chemical & Environmental Engineering，China University of Mining &Technology（Beijing），Beijing 100083；2. China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015；3. Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085；4. Chateau SunGod GreatWall，Zhangjiakou 075400）

Brewing grape wine is a process involved by many microorganisms that generally come from the grape berries if without exogenous inoculation. The high-throughput sequencing technology was used to analyze the microbial communities on the surface of different cultivars of wine grapes in Shacheng，China，which aims to understand the quality of the wine grapes，and provide the theoretical evidences for investigating the influences of microorganisms on the quality of brewing. The results showed that the richest microbial communities among these wine grapes were Riesling no matter of bacteria or fungi. The bacteria mainly were distributed in 8 phyla of Proteobacteria，Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes，etc.，and 6 dominant genera of Erwinia，Pseudomonas，Bacillus，and so on. The 3 phyla of the fungi were Ascomycota，Basidiomycota，and Zygomycota；and the 9 genera of fungi were Alternaria，Cladosporium，Phoma，F(xiàn)usarium，etc. The most similar species of the bacterial core OTUs were Arthrobacter sp. and Pseudomonas sp.，as well as Cladosporium sp.，Phoma sp.，Alternaria sp. and a lot of unknown ones for the fungal core OTUs. This study illustrates that the cultivar is the most important factor affecting the microbial communities. And from the results，it is inferred that the microorganisms on the surfaces of the wine grapes may be beneficial or adverse to the health of the grape vine，the quality of the grape berries and the process of wine brewing.

wine grape；high-throughput sequencing；microbial community；grape wine quality；bacterial diversity；fungal diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.019

2016-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31570494），國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2015FA31720），北京市科技新星計(jì)劃（xx2016B079）

張世偉，女，博士研究生，研究方向：微生物代謝流；E-mail：zhangdan1987114@163.com

鐘其頂，男，高級(jí)工程師，研究方向：食品安全；E-mail：zhongqiding@163.com

白志輝，男，研究員，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)與微生物生態(tài)學(xué)；E-mail：zhbai@rcees.ac.cn