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        禽流感血凝和血凝抑制試驗的影響因素分析

        2017-04-06 15:36:40郭新鋼
        獸醫(yī)導刊 2017年8期
        關(guān)鍵詞:移液器血凝滴度

        郭新鋼

        (烏魯木齊經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)(頭屯河區(qū))畜牧獸醫(yī)站,新疆烏魯木齊830023)

        禽流感血凝和血凝抑制試驗的影響因素分析

        郭新鋼

        (烏魯木齊經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)(頭屯河區(qū))畜牧獸醫(yī)站,新疆烏魯木齊830023)

        在進行禽流感血凝和血凝抑制試驗時,要嚴格按照操作規(guī)程,考慮多方面的因素,尤其要注意各步驟操作的細節(jié),認真細致地進行操作,盡量消除不利影響,減少誤差,確保試驗結(jié)果的準確性。

        禽流感血凝;血凝抑制;試驗

        影響禽流感血凝和血凝抑制試驗結(jié)果的因素很多,因此,試驗過程中一定要注意質(zhì)量控制,統(tǒng)一試驗標準,規(guī)范操作程序,這樣才能獲得準確、有效的試驗數(shù)據(jù),才能科學評價免疫效果,為禽流感防控提供有力的技術(shù)支撐。

        1 血清的處理及保存

        1.1 溶血

        造成溶血的因素有很多,像注射器或容器不干燥、不清潔;穿刺不順利,組織損傷過多;淤血時間過長;抽血速度太快;血液注入容器時未取下針頭或注入速度過快產(chǎn)生大量泡沫;振蕩過于劇烈等,在實際操作中都應該注意。筆者采用一次性注射器進行采血,然后帶回實驗室讓血清在注射器中自然析出,很好地避免了溶血的出現(xiàn)。

        1.2 分離血清

        采集的血樣應傾斜放置于室溫或37℃恒溫箱內(nèi)(冬天常采用該方法),一般1~2h可析出血清。如果條件不允許,則應盡快送實驗室進行離心。

        1.3 膠凍樣血清

        筆者在多次采集血樣時,有時會遇到少數(shù)膠凍樣血清,可能與血液中脂類含量過高有關(guān)。處理辦法是用一根潔凈的玻璃或塑料棒將膠凍樣的血清挑起,在管壁上擠壓幾下,用適當?shù)霓D(zhuǎn)速和時間離心,即得到供抗體檢測的血清樣。

        1.4 血清的保存

        在5d內(nèi)測定的血清樣品可放置于4℃的冰箱中冷藏。樣品待檢時間超過1周的,需低溫冰凍保存。保存的血清樣品一定要作好標記和封閉。有時冷凍保存的血清樣品需要多次檢測,血清需要反復凍融,這時要注意,檢測結(jié)果已不準確。筆者選擇免疫抗體水平較高的30份血清,平均分成A、B、C3組,A組被檢血清反復凍融,B組檢測抗原反復凍融,C組為對照組。3個試驗組同時做血凝抑制試驗,得到的結(jié)果是:A組抗體水平比對照組低1個滴度,B組抗體水平比對照組低2個滴度??梢姌悠贩磸蛢鋈趯Y(jié)果有影響。建議樣品反復凍融不應超過5次,對于確實需要多次分批檢測的,可將血清樣品分裝。

        2 器材選用

        2.1 微量血凝板

        微量血凝板使用一次性塑料反應板能夠避免清洗和磨損問題。

        2.2 微量移液器

        微量移液器有多道和單道2種,使用前或使用一段時間后應進行校正或鑒定,使用時一定要掌握正確的操作方法,吸頭要安裝牢固,防止漏氣和掉落,手按壓時下的力度要均勻,吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開,還要注意細節(jié)問題,如預先吸取樣品溶液,然后再正式移液;吸頭管嘴浸入液面的深度不要過深等,從而盡可能地減少誤差。

        2.3 移液器槍頭

        移液器槍頭要選擇質(zhì)量好的,槍頭光滑筆直,不易在管壁上掛液,在用多道微量移液器時一定要注意安裝上槍頭管嘴能夠并齊。

        3 試驗操作

        3.1 緩沖液

        試驗使用的稀釋液最好為0.01mol/LpH值為7.0~7.2的等滲磷酸緩沖液(PBS),盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用,如果用生理鹽水代替緩沖液有可能會產(chǎn)生誤差,因為生理鹽水不具備緩沖功能。針對稀釋液對禽流感血凝及血凝抑制試驗的影響進行了試驗研究。結(jié)果顯示,用pH值為7.0的PBS緩沖液測定抗原的血凝滴度比常用生理鹽水和調(diào)pH值至7.0的生理鹽水高出將近一倍,測定的陽性血清的抗體滴度高出一個孔。

        3.2 1%紅細胞懸液

        配制紅細胞懸液應采集3只或以上成年健康SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的公雞,在洗滌紅細胞時要去除表面的白細胞膜,否則將影響紅細胞的敏感性。最好用與試驗血清來源相同的禽種紅細胞,以避免易產(chǎn)生非特異現(xiàn)象。

        3.3 4個血凝單位抗原

        抗原必須在有效期內(nèi)使用。先對抗原做血凝試驗,以抗原與紅細胞完全凝集的孔作為抗原效價,再根據(jù)抗原效價,配成4個血凝單位(HAU)抗原,4個HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配,室溫下放置不要超過4h,不可反復凍融。防止4個HAU抗原配制不準確??乖残枰侄啻问褂茫瑸楸苊饪乖磸蛢鋈?,對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響,可根據(jù)實驗樣品量將抗原分裝。

        3.4 加樣

        在試驗中需要加PBS、待檢血清、4個血凝單位抗原、1%紅細胞懸液。加樣時須注意以下幾點:抗原和紅細胞使用前一定要回歸室溫并充分混勻,保證每一孔中加入的濃度準確一致;注意吸頭勿碰觸到U型或V型板孔,以免發(fā)生交叉污染;加樣時應將所加物加在U型或V型板的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出;倍比稀釋血清時,移液器吸頭不要離開液面,防止產(chǎn)生氣泡,造成移液量不準。

        3.5 孵育

        凝集板在孵育靜置過程中,一定要耐心等待,不要在凝集過程中振動凝集板。孵育溫度對試驗的影響較大,從4~37℃,隨著溫度的上升,HA與HI的滴度也跟著升高。同時,溫度的高低也影響到反應的速度,溫度過低反應速度減慢,溫度過高會使反應結(jié)果洗脫加快,所以孵育溫度??刂圃?4℃為最佳。此外,孵育時間也須嚴格控制,一般來說,以紅細胞對照完全沉淀的前后5min內(nèi)判定試驗結(jié)果較好,大約在30~40min左右。

        4 結(jié)果判定

        在環(huán)境溫度24℃,經(jīng)過15~30min即可讀出抗原效價和血清抗體滴度。當溫度過低,出現(xiàn)結(jié)果要慢;環(huán)境溫度過高,超過30℃時,試驗結(jié)果出現(xiàn)得要快,一旦時間過長,結(jié)果就會消失,使整板無凝集現(xiàn)象。判讀試驗結(jié)果時,將微量反應板傾斜45°,孔底沉淀的紅細胞流動呈淚珠樣流淌,邊緣無凝集顆粒者為凝集完全抑制。

        5 小結(jié)

        在進行禽流感血凝和血凝抑制試驗時,一定要注意并避免以上問題,充分考慮到各方面的影響因素,才能得出準確可靠地實驗數(shù)據(jù),準確掌握禽類的免疫抗體水平,使監(jiān)測工作更具有指導性的意義,做到早發(fā)現(xiàn)早預防早治療,進而為科學防控禽流感提供理論依據(jù)。

        [1] 徐運芳.淺談影響禽流感血凝抑制試驗的因素[J].中國獸醫(yī)雜志,2011,47(3):84-85.

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