張昀，熊芳，徐洪燕，肖瀟，肖菊霞，周萍

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院，江蘇 無錫 214000）

激素替代-凍融胚胎移植周期子宮內(nèi)膜的最佳容受時(shí)間研究

張昀，熊芳，徐洪燕，肖瀟，肖菊霞，周萍

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院，江蘇 無錫 214000）

目的探討激素替代-凍融胚胎移植（HRT-FET）周期子宮內(nèi)膜的最佳容受時(shí)間。方法 根據(jù)子宮內(nèi)膜暴露于黃體酮天數(shù)的不同（3、4、5、6和7 d），將52例行HRT-FET的患者依次定義為P3組、P4組、P5組、P6組及P7組，分別觀察各組胞飲突形態(tài)及覆蓋面積，并檢測(cè)整合素αvβ3、同源框基因A10（HOXA10）及LIF 3種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 多數(shù)患者在黃體酮補(bǔ)充6 d時(shí)，其子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育程度與αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白表達(dá)水平一致性達(dá)到最高。結(jié)論 將胞飲突發(fā)育程度檢測(cè)作為凍融胚胎移植時(shí)間評(píng)估的參考依據(jù)是可行，于黃體酮補(bǔ)充3 d時(shí)對(duì)胚胎進(jìn)行移植，可能是實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜與胚胎同步化的理想選擇。

激素替代-凍融胚胎移植；子宮內(nèi)膜；容受

輔助生殖技術(shù)雖然提高激素替代-凍融胚胎移植（hormone replacement therapy-frozen embryo transfer，HRT-FET）的妊娠率，但是胚胎種植失敗仍時(shí)有發(fā)生[1]。受雌、孕激素影響，子宮內(nèi)膜發(fā)生形態(tài)改變以利于胚胎黏附與著床，即種植窗。過早或過晚都將導(dǎo)致胚胎種植不接納。種植窗開放于黃體中期，各時(shí)間子宮內(nèi)膜容受性取決于胞飲突完全發(fā)育成熟及整合素αvβ3（integrin alpha v beta 3，αvβ3）、同源框基因A10（homebox A10 gene，HOXA10）蛋白和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）[2-3]表達(dá)。關(guān)于黃體酮在HRT周期內(nèi)補(bǔ)充多長(zhǎng)時(shí)間最有利于胚胎移植，尚未見報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年7月-2015年9月在本院因輸卵管性不孕或男性因素不育而接受輔助生殖技術(shù)治療，并即將行HRT-FET周期的52例女性患者作為研究對(duì)象。年齡22～35歲，平均（27.6±3.7）歲。所有納入患者有規(guī)律月經(jīng)周期、正常的基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平，并未使用任何宮內(nèi)節(jié)育器；同時(shí)將合并有子宮畸形、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位、盆腔粘連的患者，以及反復(fù)發(fā)生種植失敗的患者排除在外。所有受試者簽署知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

52例患者接受激素替代治療，自月經(jīng)周期第3天開始連續(xù)7 d給予戊酸雌二醇，3 mg/次，2次/d，7 d后將服藥劑量調(diào)整至4 mg/次，連續(xù)服用6 d。在患者服藥過程中采用陰道超聲對(duì)其子宮內(nèi)膜厚度（2個(gè)外強(qiáng)回聲線間的最大距離）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，若經(jīng)上述給藥后厚度＜8 mm，再按調(diào)整后的劑量繼續(xù)用藥3 d左右；當(dāng)厚度≥8 mm后應(yīng)用黃體酮（Progesterone，P）陰道緩釋凝膠，90 mg/d。根據(jù)子宮內(nèi)膜暴露于P的天數(shù)（3、4、5、6和7 d）將52例患者全部入組，共5組，依次定義為P3組（9例）、P4組（11例）、P5組（12例）、P6組（11例）及P7組（9例）。各組患者的年齡、不孕年限及子宮內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者在P完成給藥的次日采用pipelle內(nèi)膜導(dǎo)管進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本的采集，取得樣本后立即采用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后將各組樣本分作2份，其中一份采用2.5%戊二醛固定處理后于4℃條件下保存，制成電鏡標(biāo)本后即采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行胞飲突形態(tài)及覆蓋面積的觀察。其中，胞飲突形態(tài)主要依據(jù)其發(fā)育狀態(tài)的分級(jí)情況進(jìn)行判定，分為5級(jí)，分別為發(fā)育前、發(fā)育中、發(fā)育完全、衰退期及發(fā)育后。覆蓋面積即胞飲突占子宮內(nèi)膜表面面積的百分比，每份樣本隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域，放大2 000倍進(jìn)行觀察，完全未覆蓋（0%）計(jì)0分，少量覆蓋（≤20%）計(jì)1分，中等覆蓋（21～50%）計(jì)2分，大量覆蓋（＞50%）計(jì)3分，最后計(jì)算每份樣本的平均得分。另一份在清洗后立即用液態(tài)氮冷凍，并放置于-80℃冰箱冷凍儲(chǔ)存待檢，參考文獻(xiàn)[4]完成蛋白樣品制備，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，采用Western blot檢測(cè)αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。見圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 胞飲突發(fā)育狀態(tài)分級(jí) （×2 000）

2 結(jié)果

2.1 5組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突形態(tài)分級(jí)

P3組與P4組基本全處于發(fā)育前或發(fā)育中狀態(tài)，隨著子宮內(nèi)膜暴露于黃體酮時(shí)間的延長(zhǎng)，處于衰退期和發(fā)育后的例數(shù)逐漸增加，P5組7例（58.3330%）發(fā)育中，4例（33.3330%）完全發(fā)育，1例（8.3333%）衰退期；P6組1例（9.0910%）發(fā)育中，8例（72.7270%）完全發(fā)育，2例（18.1820%）衰退期；P7組1例（11.1110%）完全發(fā)育，5例（55.5560%）衰退期，3例（33.3330%）發(fā)育后。見表1。

表1 5組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突形態(tài)分級(jí) 例（%）

2.2 5組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突覆蓋面積評(píng)分比較

電鏡顯示，P3組、P4組、P5組、P6組及P7組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突覆蓋面積評(píng)分分別為（0.88± 0.09）、（0.97±0.11）、（2.38±0.16）、（2.74±0.15）和（2.41±0.14），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 439.230，P=0.000），胞飲突在子宮內(nèi)膜表面達(dá)大量覆蓋程度只存在于P5組、P6組及P7組中；P5組、P6組、P7組與P3組和P4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），P6組與P5組、P7組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），P5組與P7組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 5組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達(dá)水平比較

5組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10、LIF 3種蛋白的表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 40.142、30.423和11.883，P=0.000）；P6組3種蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高（P＜0.05）。見表2和圖2。

表25組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

表25組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

?

圖2 5組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10及LIF 3種蛋白的表達(dá)水平

3 討論

就當(dāng)前體外受精-胚胎移植在臨床開展的情況來看，F(xiàn)ET愈發(fā)變得常規(guī)化，但某些環(huán)節(jié)仍需進(jìn)一步完善。在自然周期中，成熟的子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育存在良好地同步性，這是確保其在接觸時(shí)均能處于最理想狀態(tài)的生理性基礎(chǔ)。HRT-FET周期則往往不具備這樣的條件，目前關(guān)于在FET前最佳的黃體酮持續(xù)給予時(shí)同尚未達(dá)成共識(shí)。在HRT周期中，如果子宮內(nèi)膜與胚胎未能較好同步，則可能發(fā)生種植窗口提前關(guān)閉、種植率降低或胚胎發(fā)育延遲等多種情況。如何更為滿意地實(shí)現(xiàn)同步化是當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向之一[5-6]。

有研究認(rèn)為，呈完全發(fā)育狀態(tài)胞飲突的大面積出現(xiàn)與消失分別對(duì)應(yīng)著種植窗開放與關(guān)閉的兩種狀態(tài)，并建議將胞飲突的該特征作為評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性及把握種植窗時(shí)間的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物[7]。但新近有個(gè)別學(xué)者對(duì)該觀點(diǎn)提出質(zhì)疑，尤其在胞飲突持續(xù)時(shí)間方面爭(zhēng)議頗大。有研究者認(rèn)為，胞飲突于月經(jīng)周期的黃體中期所持續(xù)的時(shí)間＜48 h[8]；另有研究者則提出，胞飲突的一般出現(xiàn)于排卵后的一小段時(shí)間內(nèi)，而持續(xù)時(shí)間則可能至黃體末期乃至妊娠11周左右[9]?；诙喾窖芯看嬖谳^大的不一致性，故有學(xué)者得出通過胞飲突并不能對(duì)人類種植窗做出精確描述的結(jié)論。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)偶爾也能在P3與P4組中觀察到呈完全發(fā)育狀態(tài)的胞飲突，雖然非常少量，但是由此推測(cè)，在黃體酮補(bǔ)充第8天內(nèi)同樣也可能存在少量的呈完全發(fā)育狀態(tài)的胞飲突。其原因可能為子宮內(nèi)膜胞飲突實(shí)為發(fā)育后的微絨毛細(xì)胞，且該發(fā)育過程受孕激素調(diào)節(jié)[10-12]。而在持續(xù)高水平孕激素的環(huán)境條件下，微絨毛細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)有一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化周期，即微絨毛細(xì)胞→發(fā)育中胞飲突→完全發(fā)育胞飲突→衰退期胞飲突→微絨毛細(xì)胞。同時(shí)本研究中，P6組有8例（72.7%）處于完全發(fā)育狀態(tài)，且該組胞飲突覆蓋面積評(píng)分也最高。故推斷盡管胞飲突會(huì)以較少數(shù)量的形式零散存在于其他黃體期時(shí)間，但呈完全發(fā)育狀態(tài)胞飲突的數(shù)量可在某一時(shí)間達(dá)峰值，該時(shí)間可能為最佳容受性時(shí)間點(diǎn)。因此，或許除對(duì)胞飲突持續(xù)時(shí)間進(jìn)行評(píng)估外，考察成熟胞飲突的數(shù)量也非常重要。

不同個(gè)體其成熟胞飲突數(shù)量達(dá)峰值的時(shí)間不完全相同。以28 d為常規(guī)周期，正常情況下的峰值出現(xiàn)時(shí)間為19～21 d（參照本研究為P5～P7），而大多數(shù)不孕女性則為第20天。在卵巢刺激周期，正常峰值時(shí)間為18～22 d，而大多數(shù)不孕女性則為第19天（第14天排卵），亦即是說較自然周期提前1～2d。在HRT周期中，不同女性峰值時(shí)間通常為周期第20～22天（參照本研究為P6～P8），黃體酮首次補(bǔ)充時(shí)間（即本研究的P1）為第15天。但未接受卵巢抑制治療患者其胞飲突出現(xiàn)的時(shí)間變化為P6～P10[13]。激素的應(yīng)用及患者個(gè)體差異可能是導(dǎo)致峰值時(shí)間不同的重要原因[14]。在本研究中，多數(shù)患者在黃體酮補(bǔ)充第5天開始有觀察到胞飲突形成，在P6日達(dá)峰值，P7日開始衰退，而P5～P7對(duì)應(yīng)自然周期的19～21d，該結(jié)果提示本研究方案中成熟胞飲突的形成時(shí)間與自然周期相似。

另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，即是αvβ3、HOXA10及LIF 3種子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平同樣也在黃體酮補(bǔ)充6 d時(shí)達(dá)最高，這與胞飲突在HRT周期中的發(fā)育情況一致。該結(jié)果提示，αvβ3、HOXA10及LIF可能與胞飲突潛存著某種關(guān)聯(lián)，并通過一定的相互作用來共同影響子宮內(nèi)膜容受性[15-16]。同時(shí)在本研究所開展的HRT方案中，黃體酮補(bǔ)充6 d子宮內(nèi)膜具最佳容受性的時(shí)間點(diǎn)。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)第3天體外凍融胚胎的發(fā)育情況及HRT周期方案，于黃體酮補(bǔ)充3 d時(shí)對(duì)第3天胚胎進(jìn)行移植，胚泡植入正好發(fā)生在胞飲突呈完全發(fā)育狀態(tài)的時(shí)間[17]。故就本研究所實(shí)施的HRT方案而言，多數(shù)患者的最佳移植時(shí)間應(yīng)該在黃體酮?jiǎng)偤醚a(bǔ)充3 d。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)種植反復(fù)失敗的患者，可以進(jìn)行HRT周期模擬，于P5 或P6后采集內(nèi)膜樣本，如樣本顯示絕大多數(shù)（＞50%）的胞飲突呈完全發(fā)育狀態(tài)，那么當(dāng)天即為是最佳容受時(shí)間，即當(dāng)天可移植。如樣本顯示胞飲突呈發(fā)展中狀態(tài)或衰退期狀態(tài)，則將最佳容受時(shí)間對(duì)應(yīng)延遲或提前1 d，即延遲1 d移植或下一周期再行移植。

綜上所述，鑒于在本研究所開展的HRT方案中，多數(shù)患者于黃體酮補(bǔ)充6 d時(shí)，其子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育程度與αvβ3、HOXA10及LIF 3種子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平一致性達(dá)最高，故從操作便捷性角度出發(fā)，將胞飲突發(fā)育程度檢測(cè)作為FET時(shí)間評(píng)估的參考依據(jù)是可行的，同時(shí)在本研究HRT-FET周期中，于黃體酮補(bǔ)充3 d時(shí)對(duì)胚胎進(jìn)行移植可能是實(shí)現(xiàn)同步化的理想選擇。

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（童穎丹 編輯）

Optimal time of endometrial receptivity in hormone replacement therapy-frozen embryo transfer cycles

Yun Zhang,Fang Xiong,Hong-yan Xu,Xiao Xiao,Ju-xia Xiao,Ping Zhou
(Wuxi Maternal and Child Health Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214000,China)

ObjectiveTo investigate the optimal time of endometrial receptivity in hormone replacement therapy-frozen embryo transfer(HRT-FET)cycles.Methods According to days of exposure to progesterone,52 cases undergoing HRT-FET were divided into P3 group,P4 group,P5 group,P6 group and P7 group. Pinopode morphology,coverage area,integrin alpha v beta 3 (αvβ3),homeobox gene A10 (HOXA10)and leukemia inhibitory factor(LIF)were detected and compared among the groups.Results Most of the cases had the highest expression of αvβ3,HOXA10 and LIF after 6-day exposure to progesterone.Conclusions It is feasible to evaluate the degree of sporadic development of embryos as embryo transfer time.The transplantation of the embryo on the 3rd day of progesterone supplementation may be an ideal choice for the synchronization of endometrium and embryo.

hormone replacement therapy-frozen embryo transfer;endometrium;endometrial receptivity

R<714.8 class="emphasis_bold">714.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A714.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.011

1005-8982（2017）06-0054-05

2016-05-26