陳桂玲，張加強(qiáng)

（1.河南省義馬市義煤總醫(yī)院，河南 義馬 472300；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

右美托咪定對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓P2X3 和P2X4受體表達(dá)的影響*

陳桂玲1，張加強(qiáng)2

（1.河南省義馬市義煤總醫(yī)院，河南 義馬 472300；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

目的探討右美托咪定對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓P2X3和P2X4受體表達(dá)的影響。方法 60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、神經(jīng)病理性痛組（NP組）和右美托咪定干預(yù)組（DI組），復(fù)制神經(jīng)病理性痛大鼠模型。于模型復(fù)制即刻，DI組大鼠腹腔注射40μg/kg右美托咪定，間隔24 h給藥1次，連續(xù)進(jìn)行至模型復(fù)制成功后14 d，Sham組和NP組給予等量生理鹽水腹腔注射。分別于復(fù)制模型前（T0）、復(fù)制模型后24 h （T1）、72 h（T2）、7 d（T3）和14 d（T4），對(duì)大鼠機(jī)械縮足閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）進(jìn)行測(cè)定。Western blot檢測(cè)大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與Sham組比較，NP組和DI組大鼠T1、T2、T3、T4時(shí)MWT和TWL降低；與NP組比較，DI組大鼠T2、T3、T4時(shí)MWT和TWL升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白升高；與NP組相比，DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 右美托咪定可有效改善神經(jīng)病理性痛大鼠痛覺(jué)過(guò)敏癥狀，可能與抑制脊髓中P2X3和P2X4受體蛋白的表達(dá)有關(guān)。

右美托咪定；神經(jīng)病理性痛；P2X3受體；P2X4受體

神經(jīng)病理性痛作為臨床上常見(jiàn)的疼痛類型，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，患者常表現(xiàn)為自發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏等，尚無(wú)特效治療手段，且發(fā)病率較高，給患者身心帶來(lái)巨大痛苦[1]。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）作為機(jī)體能量供應(yīng)物質(zhì)，亦具有神經(jīng)遞質(zhì)功能。研究表明，ATP參與神經(jīng)病理性痛發(fā)病過(guò)程[2]。P2X受體是配體門控陽(yáng)離子通道受體，是ATP主要受體。研究表明，神經(jīng)病理性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3和P2X4受體表達(dá)上調(diào)[3-4]。右美托咪定是臨床上常用的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有高度選擇性，是常用的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物[5]，但其具體的鎮(zhèn)痛機(jī)制尚未明確，本研究嘗試?yán)糜颐劳羞涠▽?duì)神經(jīng)病理性痛大鼠進(jìn)行鎮(zhèn)痛，觀察其鎮(zhèn)痛效果，探討其可能的作用機(jī)制，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠60只，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK（豫）2011-0003]，體重180～220 g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，自由攝食、進(jìn)水。利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、神經(jīng)病理性痛組（NP組）和右美托咪定干預(yù)組（DI組），每組20只。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前在獨(dú)立環(huán)境中適應(yīng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)病理性痛大鼠模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)[6]中的方法復(fù)制大鼠神經(jīng)病理性痛模型。腹腔注射80 mg/kg巴比妥鈉麻醉后，對(duì)右后肢大腿進(jìn)行備皮，消毒后，將皮膚沿右股骨下緣切開(kāi)，對(duì)肌肉進(jìn)行鈍性分離使坐骨神經(jīng)充分暴露，于坐骨神經(jīng)分叉前，用4號(hào)鉻制羊腸線連打4個(gè)松結(jié)，結(jié)與結(jié)間隔1 mm，讓神經(jīng)外膜輕微受壓，力度以足指輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)。將肌肉、筋膜及皮膚進(jìn)行縫合后，將鼠重新放回籠子進(jìn)行飼養(yǎng)，大鼠出現(xiàn)跛行、舔舐及懸空后肢等說(shuō)明模型復(fù)制成功。Sham組大鼠將將坐骨神經(jīng)暴露3～4 min，不進(jìn)行打結(jié)。

1.2.2 干預(yù)措施 于神經(jīng)病理性痛模型復(fù)制即刻，DI組大鼠腹腔注射40 μg/kg右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20090251），間隔24h給藥1次，連續(xù)進(jìn)行至建模后14 d，Sham組和NP組給予等量生理鹽水腹腔注射，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠未出現(xiàn)死亡。

1.2.3 機(jī)械縮足閾值 （mechanicalwithdrawal threshold，MWT）和熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測(cè)定 分別于復(fù)制模型前（T0）、復(fù)制模型后24 h（T1）、72 h（T2）、7 d（T3）和14 d （T4），對(duì)大鼠MWT和TWL進(jìn)行測(cè)定。將大鼠置于有機(jī)玻璃罩中，待其適應(yīng)、安靜后，用美國(guó)Stoelting公司生產(chǎn)的Von Frey纖維絲，由小到大施加不同垂直壓力刺激大鼠左后腳掌第3、4趾間皮膚，直到出現(xiàn)抬足或舔足行為，重復(fù)測(cè)3次，每次間隔5 min，取均值作為MWT。大鼠在有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)20 min后，用北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的熱痛刺激儀照射大鼠足底，記錄大鼠從開(kāi)始照射到出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間，連續(xù)測(cè)3次，每次間隔5 min，取均值作為TWL。

1.2.4 Western blot檢測(cè)大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達(dá) 于復(fù)制模型后14 d測(cè)定MWT和TWL，將大鼠進(jìn)行麻醉，處死后留取脊髓L4～6節(jié)段，10只大鼠的脊髓樣品用于總蛋白提取。樣品充分研磨后加入細(xì)胞裂解液（上海瑞齊生物科技有限公司）和蛋白酶抑制劑，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法對(duì)獲得的總蛋白定量。另外10只大鼠的脊髓樣品用于膜蛋白提取。脊髓樣品用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次后，用膜蛋白抽提試劑盒（上海勱瑞生物科技有限公司）提取細(xì)胞膜蛋白，用BCA法對(duì)獲得的細(xì)胞膜蛋白定量。分別取30μg總蛋白和膜蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用3%胎牛血清封閉2 h，分別將兔抗大鼠P2X3受體、P2X4R多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司，1∶500稀釋）加入，4℃過(guò)夜孵育，用三羥基甲胺-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffer saline，TBS）緩沖液沖洗3次，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000稀釋）加入，室溫下孵育60 min，用TBS緩沖液沖洗3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海通善生物科技有限公司）發(fā)光顯像，用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行分析，分別獲得脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠的行為表現(xiàn)

3組大鼠在復(fù)制模型中和復(fù)制模型后均未出現(xiàn)死亡及術(shù)側(cè)后肢感染、自噬、運(yùn)動(dòng)功能喪失等。Sham組大鼠復(fù)制模型前后術(shù)側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)未表現(xiàn)出現(xiàn)明顯異常，NP組和DI組大鼠復(fù)制模型后出現(xiàn)術(shù)側(cè)后抓內(nèi)收、外翻及跛行，DI組大鼠在給予干預(yù)3 d后運(yùn)動(dòng)癥狀改善。

2.2 3組大鼠不同時(shí)間MWT和TWL的變化

2.2.1 3組大鼠MWT比較 Sham組、NP組和DI 組T1、T2、T3、T4的MWT比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的MWT有差異（F=43.857，P=0.000）。②Sham組、NP組及DI組的MWT有差異（F=109.642，P=0.000），NP組、DI組較Sham組的MWT低，DI組較NP組的MWT高，右美托咪定可改善機(jī)械縮足閾值。③Sham組、NP組及DI組的MWT變化趨勢(shì)有差異（F=22.943，P=0.000）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間MWT比較 （n=20，g，±s）

表1 3組大鼠不同時(shí)間MWT比較 （n=20，g，±s）

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圖13組大鼠MWT不同時(shí)間變化趨勢(shì)

2.2.2 3組大鼠TWL比較 Sham組、NP組和DI 組T1、T2、T3、T4的TWL比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的TWL有差異（F= 39.672，P=0.000）。②Sham組、NP組及DI組的TWL有差異（F=91.628，P=0.000），NP組、DI組較Sham組的TWL低，DI組較NP組的TWL高，右美托咪定可改善熱縮足潛伏期。③Sham組、NP組及DI組的TWL變化趨勢(shì)有差異（F=22.943，P=0.000）。見(jiàn)表2和圖2。

表2 3組大鼠不同時(shí)間TWL比較 （n=20，s，±s）

表2 3組大鼠不同時(shí)間TWL比較 （n=20，s，±s）

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圖23組大鼠TWL不同時(shí)間變化趨勢(shì)

2.3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白表達(dá)

NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白與Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白升高。DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白與NP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白降低。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達(dá) （n=20，±s）

表3 3組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白的表達(dá) （n=20，±s）

注：1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與NP組比較，P＜0.05

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3 討論

神經(jīng)病理性痛作為臨床上常見(jiàn)的慢性頑固性疼痛，病情遷延反復(fù)，目前尚無(wú)有效的治療手段，給患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。坐骨神經(jīng)擠壓傷模型作為經(jīng)典的神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型，可模擬人類神經(jīng)病理性痛表現(xiàn)，應(yīng)用較為廣泛。本研究顯示，NP組和DI組大鼠模型復(fù)制成功后出現(xiàn)術(shù)側(cè)后抓內(nèi)收、外翻及跛行；與復(fù)制模型時(shí)比較，NP組和DI組大鼠復(fù)制模型后MWT和TWL均降低，說(shuō)明大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏及熱痛敏，表現(xiàn)出神經(jīng)病理性痛癥狀，提示成功復(fù)制神經(jīng)病理性痛大鼠模型。

右美托咪定作為新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可作用于神經(jīng)元α2A受體而發(fā)揮鎮(zhèn)痛功能[7]。本研究顯示，DI組大鼠在給予干預(yù)3 d后運(yùn)動(dòng)癥狀改善，與NP組比較，DI組大鼠T1、T2、T3、T4時(shí)MWT和TWL升高，說(shuō)明右美托咪定可有效改善神經(jīng)病理性痛大鼠疼痛癥狀。ATP作為重要的能力供應(yīng)物質(zhì)，亦可與細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)的功能，在疼痛產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]。P2X受體是ATP主要的受體類型，P2X3受體在與傷害性信息傳遞相關(guān)的中樞及外周神經(jīng)細(xì)胞中分布廣泛，在疼痛信息傳遞及調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9]。有研究指出，P2X3受體在坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的神經(jīng)性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)上調(diào)[10]。特異性抑制P2X3受體表達(dá)對(duì)大鼠的鎮(zhèn)痛功能[11]。P2X4受體作為ATP受體類型之一，主要在脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過(guò)程[12]。本研究顯示，與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白均升高，說(shuō)明P2X3和P2X4受體均參與神經(jīng)病理性痛發(fā)生過(guò)程。分析其原因，可能是在外周神經(jīng)受損后，炎癥介質(zhì)或損傷通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)而使胞核中轉(zhuǎn)錄因子被激活，使P2X3和P2X4受體被大量轉(zhuǎn)錄及翻譯而參與痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)生[13]。而且在生物功能發(fā)揮中，只有位于細(xì)胞膜上的受體與配體結(jié)合才能發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。本研究顯示，與Sham組比較，NP組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體膜蛋白均升高，說(shuō)明在外周神經(jīng)發(fā)生損傷后，大量的炎癥介質(zhì)在促使胞核轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，亦誘導(dǎo)溶酶體的胞吐功能，使產(chǎn)生的P2X3和P2X4受體被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而加速與ATP結(jié)合而參與痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生[14]。本研究顯示，與NP組比較，DI組大鼠脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白均降低，說(shuō)明右美托咪定干預(yù)可降低脊髓P2X3和P2X4受體總蛋白及膜蛋白表達(dá)，從而患者疼痛的發(fā)生。分析其原因，右美托咪定可特異性與脊髓背角突觸前膜α2A受體結(jié)合，使突觸前抑制，減少鈣離子內(nèi)流，從而減少ATP釋放，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)而使胞核中P2X3和P2X4受體表達(dá)減少，從而影響其在疼痛發(fā)生中的作用[15]。

綜上所述，右美托咪定可有效改善神經(jīng)病理性痛大鼠痛覺(jué)過(guò)敏癥狀，可能與抑制脊髓細(xì)胞中P2X3 和P2X4受體蛋白的表達(dá)，并抑制其向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)減少與配體結(jié)合有關(guān)。

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（童穎丹 編輯）

Effects of Dexmedetomidine on expressions of P2X3 and P2X4 receptors in spinal cord of rats with neuropathic pain*

Gui-ling Chen1,Jia-qiang Zhang2
(1.General Hospital of Yima Coal Industry Group,Yima,Henan 472300,China;2.People's Hospital of Henan Province,Zhengzhou,Henan 450003,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Dexmedetomidine on the expressions of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of rats with neuropathic pain.Methods Sixty healthy male SD rats were randomly divided into sham operation group (sham group),neuropathic pain group (NP group)and Dexmedetomidine intervention group (DI group).The neuropathic-pain rat models were constructed.At the start of model construction,the rats in the DI group were intraperitoneally injected with 40 μg/kg Dexmedetomidine, which was repeated at 24-h intervals till 14 d after the models were successfully constructed.The rats in the sham group and the NP group were given intraperitoneal injection of normal saline.Mechanical withdraw threshold (MWT)and thermal withdrawal latency (TWL)of the rats were detected before model construction (T0)and 24 h(T1),72 h(T2),7 d(T3)and 14 d(T4)after model construction.The expressions of total proteins and membrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats were detected using Western blot.Results Compared with the sham group,the MWT and TWL in the NP group and the DI group were decreased at T1-4;compared with the NP group,the MWT and TWL in the DI group were increased at T2-4,the differences were statistically significant (P＜0.05).Compared with the sham group,the expressions of total proteins and membrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats in the NP group were increased;compared with the NP group,the expressions of total proteins andmembrane proteins of P2X3 receptor and P2X4 receptor in the spinal cord of the rats in the DI group were decreased,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusions Dexmedetomidine could effectively improve the symptoms of neuropathic hyperalgesia in the neuropathic-pain rats.It might be related with the inhibition of the expressions of P2X3 receptor and P2X4 receptor proteins in the spinal cord.

Dexmedetomidine;neuropathic pain;P2X3 receptor;P2X4 receptor

R741

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.006

1005-8982（2017）06-0027-05

2016-08-01

河南省2015科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No：152300410163）