丁詠偉，耿玉聰，劉燕，徐洪，張麗娟，王瑞雪，王建輝，胡啟峰，楊方

（華北理工大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063009；3.河北省唐山市第二醫(yī)院 創(chuàng)傷科，河北 唐山 063000）

環(huán)磷酸腺苷信號對矽肺纖維化形成的影響*

丁詠偉1，耿玉聰1，劉燕1，徐洪2，張麗娟2，王瑞雪1，王建輝1，胡啟峰3，楊方1

（華北理工大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063009；3.河北省唐山市第二醫(yī)院 創(chuàng)傷科，河北 唐山 063000）

目的觀察環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號在大鼠矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的變化及其對矽肺纖維化形成的影響。方法 采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)復(fù)制大鼠矽肺模型，雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別染塵0、2、4、8、12和16周。采用Masson三色染色觀察肺組織形態(tài)，采用免疫組織化學(xué)法染色和Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、纖連蛋白（Fn）、激動型G蛋白α（Gαs）、抑制型G蛋白α（Gαi2、Gαi3）及cAMP的表達(dá)。結(jié)果 Masson三色染色顯示，矽肺模型4周組細(xì)胞性結(jié)節(jié)區(qū)域可見藍(lán)紫色膠原沉積，并隨模型制備時間的延長纖維化病變區(qū)域膠原沉積逐漸增加。免疫組織化學(xué)法染色顯示，對照組α-SMA陽性表達(dá)部位在氣管及血管平滑?。辉谖文Ｐ?6周組，α-SMA表達(dá)于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。α-SMA、CollagenⅠ、Fn及Gαi2、Gαi3蛋白表達(dá)在矽肺模型4、8、12和16周較對照組逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs蛋白表達(dá)及cAMP含量較對照組下降，至染塵16周達(dá)最低。結(jié)論 cAMP的表達(dá)在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中呈下降趨勢，cAMP信號參與大鼠矽肺纖維化過程。

矽肺?。患〕衫w維細(xì)胞；環(huán)磷酸腺苷

塵肺病（包括矽肺）是由于在職業(yè)活動中長期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留，而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病。對塵肺發(fā)生、發(fā)展和防治機(jī)制的研究，一直是我國職業(yè)病研究領(lǐng)域中的難點(diǎn)及熱點(diǎn)問題。課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，β2腎上腺素受體-激動型G蛋白（β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein，ADRB2-Gs）復(fù)合物在矽肺模型組中表達(dá)下調(diào)，僅為對照組的30%[1]。研究表明，ADRB2-Gs復(fù)合物能夠促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）表達(dá)的上調(diào)，調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的合成[2]。相關(guān)研究報道，cAMP信號在心、肺、肝等纖維化模型中具有抗纖維化的作用，cAMP表達(dá)的上調(diào)能夠限制炎癥反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3-5]。由此可見cAMP信號可能具有潛在的抗矽肺纖維化的效果。本研究通過復(fù)制矽肺大鼠模型，分析肺組織中cAMP信號的動態(tài)變化與矽肺纖維化病變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3周齡雄性Wistar大鼠（50±10）g（北京維通利華動物技術(shù)有限公司），SiO2粉塵（美國Sigma-Aldrich公司），Masson三色染色試劑盒（臺灣貝索公司），α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔多克隆抗體（ab32575，美國EPITMICs公司），Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）兔多克隆抗體（ab34710，英國Abcam公司），纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)n）兔多克隆抗體（ab45688，美國EPITMICs公司），抑制型G蛋白α（inhibitory G protein α，Gαi2）兔多克隆抗體（sc-7276，美國Santa Cruz公司），Gαi3鼠單克隆抗體（sc-365422，美國Santa Cruz公司），激動型G蛋白α（stimulatory G protein α，Gαs）鼠單克隆抗體（sc-135914，美國Santa Cruz公司），cAMP兔多克隆抗體（EL140118，英國Eterlife公司），免疫組織化學(xué)法二步法試劑盒（PV-6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)（天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠成像分體系統(tǒng)（美國Biorad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型復(fù)制與標(biāo)本處理 HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)參數(shù)：染毒室容積0.3 m3，柜內(nèi)溫度20～25℃，濕度70%～75%，壓力-50～50 Pa，氧氣濃度20%，進(jìn)氣流速3.0～3.5m3/h，粉塵進(jìn)入速度為2.0～2.5 ml/min，柜內(nèi)粉塵質(zhì)量濃度為2 000 mg/m3。健康雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分對照組、2周組、4周組、8周組、12周組、16周組，每組10只。每只動物染塵3 h/d，至相應(yīng)時段處死大鼠，對照組不染塵，常規(guī)喂養(yǎng)16周后處死。取右下肺放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。其余肺組織放入液氮速凍后，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 Masson三色染色觀察肺組織病理形態(tài) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。Weigert鐵蘇木素染5～10 min，流水沖洗。1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，蒸餾水稍洗。磷鉬酸溶液短時處理約1 min，直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染1～2 min。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水。0.3%雙氧水H2O2室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min。枸櫞酸鹽高壓修復(fù)抗原。滴加一抗（α-SMA為1∶200），4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，5 min/次。滴加通用型二抗（羊抗兔/鼠）37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次,細(xì)胞色素氧化酶二氨基聯(lián)苯胺顯示法顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，流水返藍(lán)，脫水透明中性樹膠封片。

1.3.4 Western blot檢測α-SMA、CollagenⅠ、Fn、Gαs、Gαi2/3及cAMP的含量 稱取50 mg肺組織，加入500 μl含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定裂解液，充分剪碎勻漿，冰上超聲震蕩使蛋白解交聯(lián)，4℃、12 000 r/min離心15 min，提取上清蛋白，5×上樣緩沖液配蛋白。進(jìn)行上樣電泳及電轉(zhuǎn)。一抗（CollagenⅠ、α-SMA、Fn、β-actin抗體1∶500稀釋；Gαs、Gαi2、Gαi3抗體1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗溶液（1∶5 000稀釋），37℃孵育30 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，采用Image-Proplus圖像處理軟件對條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（One-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 矽肺大鼠肺組織Masson染色 （×200）

圖2 矽肺大鼠α-SMA的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×200）

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)改變

Masson三色染色顯示，自矽肺模型4周組細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積，矽肺模型8周和12周組大鼠肺組織可見肺泡間隔增寬明顯，且細(xì)胞性結(jié)節(jié)數(shù)量增多，可見部分細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合。矽肺模型16周組肺組織內(nèi)可見多個細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合和間質(zhì)纖維化的形成，并可見細(xì)胞纖維性矽結(jié)節(jié)的形成，隨模型復(fù)制時間的延長纖維化病變區(qū)域膠原沉積逐漸增加。見圖1。

2.2 大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達(dá)

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，在對照組α-SMA陽性表達(dá)于氣管及血管平滑肌。在矽肺模型16周組α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞主要位于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。見圖2。

2.3 大鼠肺組織CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示，大鼠矽肺組織中CollagenⅠ、α-SMA及Fn的蛋白表達(dá)自模型4周組開始上調(diào)，其中，CollagenⅠ在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達(dá)分別是對照組2.17、3.00、4.12和5.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組α-SMA的表達(dá)分別是對照組1.81、3.08、3.87和4.95倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Fn在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達(dá)分別為對照組的2.00、3.92、5.15和6.88倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組組間比較，CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)變化（n=10，±s）

表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)變化（n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與2周組比較，P＜0.05；3）與4周組比較，P＜0.05；4）與8周組比較，P＜0.05；5）與12周組比較，P＜0.05

?

圖3 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)

2.4 大鼠肺組織Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測結(jié)果顯示，Gαs蛋白表達(dá)在矽肺模型8周組、12周組及16周組逐漸下降，分別是對照組的52.46%、43.17%和22.95%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。cAMP的含量在矽肺模型8周組、12周組及16周組分別是對照組的63.53%、61.187% 和44.71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Gαi2、Gαi3蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高，其中Gαi2蛋白表達(dá)分別是對照組的3.20、4.30、6.80和7.70倍；與對照組比較，Gαi3蛋白表達(dá)分別是其2.15、2.92、3.58和4.15倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組各組間比較，Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2和圖4。

表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)變化 （n=10，±s）

表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)變化 （n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與2周組比較，P＜0.05；3）與4周組比較，P＜0.05；4）與8周組比較，P＜0.05；5）與12周組比較，P＜0.05

?

圖4 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)

3 討論

目前研究認(rèn)為，肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致肺組織彌漫性纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，在肺纖維化時肌成纖維細(xì)胞可來自肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[6]，內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]，周細(xì)胞[9]或胸膜間皮細(xì)胞[10]的轉(zhuǎn)化。無論何種來源，肌成纖維細(xì)胞都能特異性表達(dá)α-SMA。本研究中免疫組織化學(xué)染色顯示，在矽肺模型組16周組中，α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞位于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化區(qū)域，Westernblot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，矽肺模型組4～16周組α-SMA蛋白表達(dá)逐漸升高。提示矽肺模型中有大量活化的肌成纖維細(xì)胞。Masson三色染色顯示，在結(jié)節(jié)及纖維化病變區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積，并隨染塵時間的延長膠原沉積逐漸增加。同時肺組織Collagen I、Fn的蛋白表達(dá)自矽肺模型4周組開始上調(diào)，至矽肺模型16周組達(dá)最高，提示隨模型制備時間的延長，細(xì)胞外基質(zhì)的生成逐漸增高。以上結(jié)果表明，經(jīng)HOPE-MED8050動式染塵系統(tǒng)成功復(fù)制矽肺大鼠模型，矽肺病變進(jìn)行性加重。

第二信使cAMP廣泛參與細(xì)胞多種功能的調(diào)控。cAMP是鳥苷酸結(jié)合蛋白信號級聯(lián)的第二信使?；罨腉αs可激活A(yù)C催化腺嘌呤核苷三磷酸產(chǎn)生cAMP；相反，激活的Gαi則抑制AC活性，導(dǎo)致cAMP水平降低。另外，cAMP的濃度還與磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）有關(guān)，PDE可催化cAMP水解，進(jìn)而減弱或終止cAMP信號分子的作用。研究報道，偶聯(lián)到Gαs的受體，如腺苷A2B受體，通過增加cAMP產(chǎn)生，可抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并減少膠原合成[11]。Gαi2G184S突變小鼠Gαi2信號表達(dá)增強(qiáng)，其心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維基因表達(dá)明顯增強(qiáng)[12]。Gαi2缺陷小鼠在脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷中巨噬細(xì)胞的聚集減少，且降低RAW 264.7細(xì)胞的運(yùn)動和遷移[13]。本研究表明，Gαs/Gαi平衡可通過調(diào)節(jié)cAMP水平，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及炎癥反應(yīng)。另有研究顯示，采用AC活化劑/PDE抑制劑等均能夠有效抑制成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成[14-15]。以上研究提示，Gαs/Gαi-cAMP信號對纖維化疾病具有重要的調(diào)控作用。

在本研究中，Gαs蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組開始逐漸下降，至16周組達(dá)最低，cAMP在肺組織中的變化與Gαs蛋白一致，而Gαi2/3蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高，并伴隨α-SMA、CollagenⅠ和Fn蛋白表達(dá)的上調(diào)。綜合以上結(jié)果，cAMP信號在大鼠矽肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸減弱，cAMP信號的低表達(dá)促進(jìn)矽肺的發(fā)展。

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（童穎丹 編輯）

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Influence of cAMP signal on pathogenesis of silicotic fibrosis*

Yong-wei Ding1,Yu-cong Geng1,Yan Liu1,Hong Xu2,Li-juan Zhang2, Rui-xue Wang1,Jian-hui Wang1,Qi-feng Hu3,Fang Yang1
(1.Basic Medical College;2.Research Center of Medical Experiment,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063009,China;3.Department of Trauma, the Second Hospital of Tangshan City,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo observe the changes of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)signal in pathogenesis and development of silicotic fibrosis.Methods A HOPE-MED8050 exposure control apparatus was used to copy the silicosis model.Male Wistar rats were randomly divided into 6 groups (10 in each group) and the rats inhaled dust respectively for 0,2,4,8,12 and 16 w.Masson trichrome staining was performed to observe the histomorphology of the lung tissues.The expressions of α smooth muscle actin (α-SMA),collagenⅠ,fibronectin (Fn),stimulatory G protein α (Gαs),inhibitory G protein α (Gαi2/3)and cAMP were detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.Results Masson trichrome staining revealed bluish-purple collagen deposition in the 4-w silicosis group,and the collagen deposition in the fibrotic lesions increased with the time of exposure to silica.Immunohistochemical results showed that in the control group positive α-SMA expression was seen in the trachea and vascular smooth muscles,while in the 16-w silicosis group α-SMA was observed around the fibrotic nodules and in the interstitial fibrotic area.The expressions of α-SMA,collagen I,Fn and Gαi2/3 proteins gradually increased in the 4-w,8-w,12-w and 16-w silicosisgroups compared with the control group.As compared to the control group,the expressions of Gαs and cAMP significantly decreased in the 8-w silicosis group,and were the lowest in the the 16-w silicosis group. Conclusions cAMP expression decreases along with the pathogenesis and development of silicosis,and cAMP has a significant role in silicotic formation.

silicosis;myofibroblast;cyclic adenosine monophosphate

R135.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.001

1005-8982（2017）06-0001-05

2016-05-05

國家自然科學(xué)基金（No：81472953）；河北省自然科學(xué)基金青年基金（No：H2016209161）；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃（No：X2016218）

劉燕，E-mail：liuyan.zone@163.com；Tel：13582526275