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        環(huán)磷酸腺苷信號對矽肺纖維化形成的影響*

        2017-04-06 05:36:16丁詠偉耿玉聰劉燕徐洪張麗娟王瑞雪王建輝胡啟峰楊方
        關(guān)鍵詞:模型

        丁詠偉,耿玉聰,劉燕,徐洪,張麗娟,王瑞雪,王建輝,胡啟峰,楊方

        (華北理工大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,河北 唐山 063009;3.河北省唐山市第二醫(yī)院 創(chuàng)傷科,河北 唐山 063000)

        環(huán)磷酸腺苷信號對矽肺纖維化形成的影響*

        丁詠偉1,耿玉聰1,劉燕1,徐洪2,張麗娟2,王瑞雪1,王建輝1,胡啟峰3,楊方1

        (華北理工大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,河北 唐山 063009;3.河北省唐山市第二醫(yī)院 創(chuàng)傷科,河北 唐山 063000)

        目的觀察環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號在大鼠矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的變化及其對矽肺纖維化形成的影響。方法 采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)復(fù)制大鼠矽肺模型,雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分別染塵0、2、4、8、12和16周。采用Masson三色染色觀察肺組織形態(tài),采用免疫組織化學(xué)法染色和Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、纖連蛋白(Fn)、激動型G蛋白α(Gαs)、抑制型G蛋白α(Gαi2、Gαi3)及cAMP的表達(dá)。結(jié)果 Masson三色染色顯示,矽肺模型4周組細(xì)胞性結(jié)節(jié)區(qū)域可見藍(lán)紫色膠原沉積,并隨模型制備時間的延長纖維化病變區(qū)域膠原沉積逐漸增加。免疫組織化學(xué)法染色顯示,對照組α-SMA陽性表達(dá)部位在氣管及血管平滑?。辉谖文P?6周組,α-SMA表達(dá)于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。α-SMA、CollagenⅠ、Fn及Gαi2、Gαi3蛋白表達(dá)在矽肺模型4、8、12和16周較對照組逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs蛋白表達(dá)及cAMP含量較對照組下降,至染塵16周達(dá)最低。結(jié)論 cAMP的表達(dá)在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中呈下降趨勢,cAMP信號參與大鼠矽肺纖維化過程。

        矽肺?。患〕衫w維細(xì)胞;環(huán)磷酸腺苷

        塵肺病(包括矽肺)是由于在職業(yè)活動中長期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留,而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病。對塵肺發(fā)生、發(fā)展和防治機(jī)制的研究,一直是我國職業(yè)病研究領(lǐng)域中的難點(diǎn)及熱點(diǎn)問題。課題組以往研究發(fā)現(xiàn),β2腎上腺素受體-激動型G蛋白(β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein,ADRB2-Gs)復(fù)合物在矽肺模型組中表達(dá)下調(diào),僅為對照組的30%[1]。研究表明,ADRB2-Gs復(fù)合物能夠促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)表達(dá)的上調(diào),調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的合成[2]。相關(guān)研究報道,cAMP信號在心、肺、肝等纖維化模型中具有抗纖維化的作用,cAMP表達(dá)的上調(diào)能夠限制炎癥反應(yīng),抑制成纖維細(xì)胞的增殖,阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3-5]。由此可見cAMP信號可能具有潛在的抗矽肺纖維化的效果。本研究通過復(fù)制矽肺大鼠模型,分析肺組織中cAMP信號的動態(tài)變化與矽肺纖維化病變的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        3周齡雄性Wistar大鼠(50±10)g(北京維通利華動物技術(shù)有限公司),SiO2粉塵(美國Sigma-Aldrich公司),Masson三色染色試劑盒(臺灣貝索公司),α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)兔多克隆抗體(ab32575,美國EPITMICs公司),Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)兔多克隆抗體(ab34710,英國Abcam公司),纖連蛋白(Fibronectin,F(xiàn)n)兔多克隆抗體(ab45688,美國EPITMICs公司),抑制型G蛋白α(inhibitory G protein α,Gαi2)兔多克隆抗體(sc-7276,美國Santa Cruz公司),Gαi3鼠單克隆抗體(sc-365422,美國Santa Cruz公司),激動型G蛋白α(stimulatory G protein α,Gαs)鼠單克隆抗體(sc-135914,美國Santa Cruz公司),cAMP兔多克隆抗體(EL140118,英國Eterlife公司),免疫組織化學(xué)法二步法試劑盒(PV-6000,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)(天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),凝膠成像分體系統(tǒng)(美國Biorad公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 模型復(fù)制與標(biāo)本處理 HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)參數(shù):染毒室容積0.3 m3,柜內(nèi)溫度20~25℃,濕度70%~75%,壓力-50~50 Pa,氧氣濃度20%,進(jìn)氣流速3.0~3.5m3/h,粉塵進(jìn)入速度為2.0~2.5 ml/min,柜內(nèi)粉塵質(zhì)量濃度為2 000 mg/m3。健康雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分對照組、2周組、4周組、8周組、12周組、16周組,每組10只。每只動物染塵3 h/d,至相應(yīng)時段處死大鼠,對照組不染塵,常規(guī)喂養(yǎng)16周后處死。取右下肺放入4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。其余肺組織放入液氮速凍后,置入-80℃冰箱冷凍保存。

        1.3.2 Masson三色染色觀察肺組織病理形態(tài) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。Weigert鐵蘇木素染5~10 min,流水沖洗。1%鹽酸酒精分化,流水沖洗數(shù)分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5~10 min,蒸餾水稍洗。磷鉬酸溶液短時處理約1 min,直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染1~2 min。無水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

        1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水。0.3%雙氧水H2O2室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min。枸櫞酸鹽高壓修復(fù)抗原。滴加一抗(α-SMA為1∶200),4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3次,5 min/次。滴加通用型二抗(羊抗兔/鼠)37℃孵育30 min,PBS沖洗3次,5 min/次,細(xì)胞色素氧化酶二氨基聯(lián)苯胺顯示法顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,流水返藍(lán),脫水透明中性樹膠封片。

        1.3.4 Western blot檢測α-SMA、CollagenⅠ、Fn、Gαs、Gαi2/3及cAMP的含量 稱取50 mg肺組織,加入500 μl含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定裂解液,充分剪碎勻漿,冰上超聲震蕩使蛋白解交聯(lián),4℃、12 000 r/min離心15 min,提取上清蛋白,5×上樣緩沖液配蛋白。進(jìn)行上樣電泳及電轉(zhuǎn)。一抗(CollagenⅠ、α-SMA、Fn、β-actin抗體1∶500稀釋;Gαs、Gαi2、Gαi3抗體1∶200稀釋)4℃孵育過夜,二抗溶液(1∶5 000稀釋),37℃孵育30 min,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色,采用Image-Proplus圖像處理軟件對條帶進(jìn)行分析,以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖1 矽肺大鼠肺組織Masson染色 (×200)

        圖2 矽肺大鼠α-SMA的表達(dá) (免疫組織化學(xué)法×200)

        2 結(jié)果

        2.1 肺組織形態(tài)學(xué)改變

        Masson三色染色顯示,自矽肺模型4周組細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積,矽肺模型8周和12周組大鼠肺組織可見肺泡間隔增寬明顯,且細(xì)胞性結(jié)節(jié)數(shù)量增多,可見部分細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合。矽肺模型16周組肺組織內(nèi)可見多個細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合和間質(zhì)纖維化的形成,并可見細(xì)胞纖維性矽結(jié)節(jié)的形成,隨模型復(fù)制時間的延長纖維化病變區(qū)域膠原沉積逐漸增加。見圖1。

        2.2 大鼠肺組織α-SMA蛋白的定位表達(dá)

        免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示,在對照組α-SMA陽性表達(dá)于氣管及血管平滑肌。在矽肺模型16周組α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞主要位于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。見圖2。

        2.3 大鼠肺組織CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達(dá)的變化

        Western blot結(jié)果顯示,大鼠矽肺組織中CollagenⅠ、α-SMA及Fn的蛋白表達(dá)自模型4周組開始上調(diào),其中,CollagenⅠ在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達(dá)分別是對照組2.17、3.00、4.12和5.71倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組α-SMA的表達(dá)分別是對照組1.81、3.08、3.87和4.95倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Fn在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組的表達(dá)分別為對照組的2.00、3.92、5.15和6.88倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組組間比較,CollagenⅠ、α-SMA及Fn蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1和圖3。

        表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)變化(n=10,±s)

        表1 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)變化(n=10,±s)

        注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與2周組比較,P<0.05;3)與4周組比較,P<0.05;4)與8周組比較,P<0.05;5)與12周組比較,P<0.05

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        圖3 矽肺大鼠CollagenⅠ、α-SMA及Fn的表達(dá)

        2.4 大鼠肺組織Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP蛋白表達(dá)的變化

        Western blot檢測結(jié)果顯示,Gαs蛋白表達(dá)在矽肺模型8周組、12周組及16周組逐漸下降,分別是對照組的52.46%、43.17%和22.95%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。cAMP的含量在矽肺模型8周組、12周組及16周組分別是對照組的63.53%、61.187% 和44.71%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Gαi2、Gαi3蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高,其中Gαi2蛋白表達(dá)分別是對照組的3.20、4.30、6.80和7.70倍;與對照組比較,Gαi3蛋白表達(dá)分別是其2.15、2.92、3.58和4.15倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。矽肺模型2周組、4周組、8周組、12周組及16周組各組間比較,Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖4。

        表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)變化 (n=10,±s)

        表2 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)變化 (n=10,±s)

        注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與2周組比較,P<0.05;3)與4周組比較,P<0.05;4)與8周組比較,P<0.05;5)與12周組比較,P<0.05

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        圖4 矽肺大鼠Gαs、Gαi2、Gαi3及cAMP的表達(dá)

        3 討論

        目前研究認(rèn)為,肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致肺組織彌漫性纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞,在肺纖維化時肌成纖維細(xì)胞可來自肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[6],內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7],上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8],周細(xì)胞[9]或胸膜間皮細(xì)胞[10]的轉(zhuǎn)化。無論何種來源,肌成纖維細(xì)胞都能特異性表達(dá)α-SMA。本研究中免疫組織化學(xué)染色顯示,在矽肺模型組16周組中,α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞位于結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化區(qū)域,Westernblot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,矽肺模型組4~16周組α-SMA蛋白表達(dá)逐漸升高。提示矽肺模型中有大量活化的肌成纖維細(xì)胞。Masson三色染色顯示,在結(jié)節(jié)及纖維化病變區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積,并隨染塵時間的延長膠原沉積逐漸增加。同時肺組織Collagen I、Fn的蛋白表達(dá)自矽肺模型4周組開始上調(diào),至矽肺模型16周組達(dá)最高,提示隨模型制備時間的延長,細(xì)胞外基質(zhì)的生成逐漸增高。以上結(jié)果表明,經(jīng)HOPE-MED8050動式染塵系統(tǒng)成功復(fù)制矽肺大鼠模型,矽肺病變進(jìn)行性加重。

        第二信使cAMP廣泛參與細(xì)胞多種功能的調(diào)控。cAMP是鳥苷酸結(jié)合蛋白信號級聯(lián)的第二信使?;罨腉αs可激活A(yù)C催化腺嘌呤核苷三磷酸產(chǎn)生cAMP;相反,激活的Gαi則抑制AC活性,導(dǎo)致cAMP水平降低。另外,cAMP的濃度還與磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)有關(guān),PDE可催化cAMP水解,進(jìn)而減弱或終止cAMP信號分子的作用。研究報道,偶聯(lián)到Gαs的受體,如腺苷A2B受體,通過增加cAMP產(chǎn)生,可抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并減少膠原合成[11]。Gαi2G184S突變小鼠Gαi2信號表達(dá)增強(qiáng),其心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維基因表達(dá)明顯增強(qiáng)[12]。Gαi2缺陷小鼠在脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷中巨噬細(xì)胞的聚集減少,且降低RAW 264.7細(xì)胞的運(yùn)動和遷移[13]。本研究表明,Gαs/Gαi平衡可通過調(diào)節(jié)cAMP水平,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及炎癥反應(yīng)。另有研究顯示,采用AC活化劑/PDE抑制劑等均能夠有效抑制成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成[14-15]。以上研究提示,Gαs/Gαi-cAMP信號對纖維化疾病具有重要的調(diào)控作用。

        在本研究中,Gαs蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組開始逐漸下降,至16周組達(dá)最低,cAMP在肺組織中的變化與Gαs蛋白一致,而Gαi2/3蛋白表達(dá)在矽肺模型4周組、8周組、12周組及16周組逐漸升高,并伴隨α-SMA、CollagenⅠ和Fn蛋白表達(dá)的上調(diào)。綜合以上結(jié)果,cAMP信號在大鼠矽肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸減弱,cAMP信號的低表達(dá)促進(jìn)矽肺的發(fā)展。

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        (童穎丹 編輯)

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        Influence of cAMP signal on pathogenesis of silicotic fibrosis*

        Yong-wei Ding1,Yu-cong Geng1,Yan Liu1,Hong Xu2,Li-juan Zhang2, Rui-xue Wang1,Jian-hui Wang1,Qi-feng Hu3,Fang Yang1
        (1.Basic Medical College;2.Research Center of Medical Experiment,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063009,China;3.Department of Trauma, the Second Hospital of Tangshan City,Tangshan,Hebei 063000,China)

        ObjectiveTo observe the changes of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)signal in pathogenesis and development of silicotic fibrosis.Methods A HOPE-MED8050 exposure control apparatus was used to copy the silicosis model.Male Wistar rats were randomly divided into 6 groups (10 in each group) and the rats inhaled dust respectively for 0,2,4,8,12 and 16 w.Masson trichrome staining was performed to observe the histomorphology of the lung tissues.The expressions of α smooth muscle actin (α-SMA),collagenⅠ,fibronectin (Fn),stimulatory G protein α (Gαs),inhibitory G protein α (Gαi2/3)and cAMP were detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.Results Masson trichrome staining revealed bluish-purple collagen deposition in the 4-w silicosis group,and the collagen deposition in the fibrotic lesions increased with the time of exposure to silica.Immunohistochemical results showed that in the control group positive α-SMA expression was seen in the trachea and vascular smooth muscles,while in the 16-w silicosis group α-SMA was observed around the fibrotic nodules and in the interstitial fibrotic area.The expressions of α-SMA,collagen I,Fn and Gαi2/3 proteins gradually increased in the 4-w,8-w,12-w and 16-w silicosisgroups compared with the control group.As compared to the control group,the expressions of Gαs and cAMP significantly decreased in the 8-w silicosis group,and were the lowest in the the 16-w silicosis group. Conclusions cAMP expression decreases along with the pathogenesis and development of silicosis,and cAMP has a significant role in silicotic formation.

        silicosis;myofibroblast;cyclic adenosine monophosphate

        R135.2

        A

        10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.001

        1005-8982(2017)06-0001-05

        2016-05-05

        國家自然科學(xué)基金(No:81472953);河北省自然科學(xué)基金青年基金(No:H2016209161);華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃(No:X2016218)

        劉燕,E-mail:liuyan.zone@163.com;Tel:13582526275

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