瞿笑豐，陳麗欣，蕭文澤

·綜述·

外泌體在缺血性腦卒中的研究進展

瞿笑豐a，陳麗欣b，蕭文澤c

外泌體是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞外小分子囊泡，其參與調節(jié)缺血性卒中后神經細胞重塑以及血管新生。本文總結了外泌體在缺血性卒中修復過程中的研究進展，并探討缺血性卒中治療中干細胞來源外泌體的潛在應用價值。

外泌體；缺血性卒中；血管新生；神經細胞可塑性；造血干細胞治療

外泌體（exosomes）存在于體液如血液和腦脊液中[1]，是內體衍生的小膜泡，直徑約 30～100 nm，由細胞釋放到細胞外液[1]。其內攜帶有蛋白質、脂類和遺傳物質，在源細胞和受體細胞間起著關鍵的細胞間通訊作用[1]。數(shù)據(jù)表明，外泌體也參與調節(jié)卒中后神經血管單元組件細胞間的通訊。筆者總結了外泌體在卒中后修復中的研究進展，并探討腦卒中治療中外泌體的潛在應用價值。

1 外泌體調節(jié)缺血性卒中相關miRNA水平

在局灶性腦缺血小鼠模型中下調腦血管內皮細胞 miRNA-15a，可以促進缺血周邊區(qū)的血管新生[3]。血管內皮細胞釋放的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可與神經祖細胞的血 管 內 皮 生 長 因 子 受 體 2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）結合，促進其增殖和分化。此外，腦白質內皮細胞通過腦源性神經營養(yǎng) 因 子（brain derived neurophic factor，BDNF）和 腦源性成纖維細胞生長因子 2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）參與髓鞘少突膠質細胞的再生[2]。卒中誘發(fā)的有限的神經芽生和缺血周邊區(qū)軸突的髓鞘再生也受到 miRNA 的調控[4]。而反應性增生的星形膠質細胞產生的硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）則抑制軸突再生[5]。皮質神經元過表達 miR-17-92 基因簇或 miR-27a，可激活神經元的內在生長信號通路，這主要通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tension homolog，PTEN）和 Ras同源家族成員（RhoA）信號，從而克服 CSPG 的抑制作 用[6]。 因此，miRNA 和 mRNA的介導信號網(wǎng)絡在卒中腦修復過程中起到關鍵性作用[7]。外泌體介導的細胞間通訊通過將生物分子從源細胞轉移至靶細胞也參與神經功能的修復。外泌體通常富含 tetraspanin 蛋白（CD63、CD81），核內體調節(jié)器 Alix，和伴侶蛋白 HSP70，其攜帶的成分有脂類、蛋白和 RNA，包括 mRNA 和 miRNA[1]。

2 外泌體調節(jié)缺血性腦卒中后血管新生

循環(huán)內皮祖細胞分泌的外泌體可將其包含物轉移到受體內皮細胞，其中包含 PI3K/Akt信號通路相關 miRNA 和促血管生成相關的 miRNA，如 miR-126 和 miR-296。在大腦，培養(yǎng)的膠質瘤細胞分泌的外泌體提供促血管生成的蛋白質、mRNA和miRNA給腦血管內皮細胞，誘導新生血管生成。此外，人腦微血管內皮細胞也分泌外泌體[8]。小鼠腦內皮細胞分泌的外泌體在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激和細胞因子刺激下轉移miRNA、mRNA和受體至小鼠腦血管周細胞，提高了VEGF-B及其受體VEGFR-1 蛋 白 水 平[9]，介 導 血 管 生 成 。 Delta-like 4（DLL4），一種腦內皮細胞表達的膜結合 Notch 配體，通過與周細胞的 Notch3 受體結合，保持腦血管結構穩(wěn)定[10]。人類微血管內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞釋放的外泌體含有DLL4蛋白，參與調節(jié)血管生成[11]。

蛋白質組學和基因芯片分析顯示，與非缺血組相比，缺血性卒中從本質上改變了外泌體所裝載的miRNA 與蛋白成分[12]。 缺血性神經祖細胞來源的外泌體促進初級內皮細胞遷移和毛細血管的形成，而缺血性腦血管內皮細胞外泌體促進了神經祖細胞的增殖和分化[12]。這表明，腦血管內皮細胞和神經祖細胞的外泌體共同參與了卒中后大腦修復過程中的神經和血管生成過程。

3 外泌體促進缺血性腦卒中后神經再生

成年老鼠大腦神經干細胞存在于腦室/腦室旁區(qū)（ventricular/subventricular,V/SVZ），此 區(qū) 域 毗 鄰血管和腦脊液，不斷地交換分子信號[13]。腦脊液和神經干細胞釋放的外泌體各自通過調節(jié)細胞間信號途徑，介導的神經干細胞的功能和免疫功能[14]。腦脊液來源外泌體激活胚胎神經干細胞 IGF/mTORC1通路，促進干神經細胞的增殖[14]。將成年老鼠的胚胎神經干細胞暴露在促炎性因子環(huán)境中，促使其釋放干擾素信號通路γ相關成分。這些外泌體通過所裝載的干擾素 γ及其受體 IFNGR1 激活靶細胞內STAT1 信號通路[15]。卒中可以激活先天免疫和適應性免疫反應，因此，神經干細胞釋放的外泌體也可能參與了卒中后免疫系統(tǒng)細胞相互作用。

4 外泌體調節(jié)缺血性腦卒中后神經細胞可塑性

神經元和神經膠質細胞相互作用來協(xié)調軸突生長和髓鞘形成，這兩者釋放的外泌體也參與這些過程[16]。神經元釋放的外泌體含有α-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體，而去極化神經元其突起釋放的外泌體富含微管相關蛋白 1B（MAP1B）和 miRNA 靶 基 因 ，這 些 成 分 均 參 與 了 神 經 可 塑 性[17]。 維 甲 酸 受 體RARβ2激動劑通過釋放富含PTEN蛋白的外泌體抑制皮質神經元PTEN信號轉導。同時，這些PTEN蛋白的外泌體與PTEN星形膠質細胞結合，抑制星形膠質細胞增殖[18]。此外，皮質神經元外泌體轉移 miR-124 至星形膠質細胞，促使星形膠質細胞上調興奮性氨基酸谷氨酸轉運體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）表達，調節(jié)星形膠質細胞的功能[19]。AMPA 受體和 MAP1B 是突觸可塑性和軸突出芽的關鍵調節(jié)受體[17]。而在嚙齒動物，星形膠質細胞GLT-1主要負責調節(jié)細胞外谷氨酸水平和調節(jié)突觸活化[19]。AMPA 受體的激活有助于腦卒中后運動功能恢復[20]?？傊?，外泌體介導了神經元和星形膠質細胞之間突觸傳遞和生物分子的交流[17]，參與調節(jié)了神經元突觸和軸突可塑性。

5 外泌體影響缺血性腦卒中模型中神經膠質細胞功能

高濃度氯化鉀導致新生小鼠星形膠質細胞釋放外泌體，他們富含突觸囊泡相關蛋白 synapsin，促進軸突生長和神經元的存活[21]，不同濃度的氯化鉀均可誘導缺血腦組織的星形膠質細胞分泌的外泌體[21]。

體外培養(yǎng)的少突膠質細胞同樣分泌外泌體，其外泌體的分泌受到細胞內鈣水平調節(jié)。興奮性神經元來源的谷氨酸刺激少突膠質細胞釋放攜帶 MBP、PLP 和 sirtuin-2 的外泌體[22]，這些蛋白通過激活靶細胞 Rho/ROCK/myosin 受體的信號蛋白抑制髓鞘 形 成[23]。 透 射 電 鏡 分 析 表明 ，在 軸 突 周 圍 存 在 PLP+ 多 泡體[24]，表明外泌體有助于協(xié)調神經元介導的髓鞘形成[24]。少突膠質細胞來源的外泌體可以被神經元內化，從而提高神經元在細胞應激環(huán)境下的生存能力[22]。在腦缺血體外試驗中，對大鼠皮質神經元進行氧/葡萄糖剝奪，少突膠質細胞來源的外泌體通過激活的超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和其他抗氧化酶，減少缺血性神經元死亡[25]。

原代培養(yǎng)的小膠質細胞和小膠質細胞細胞系釋放的外泌體均含有氨肽酶 CD13 和乳酸轉運單羧酸轉運蛋白 1（monocarboxylate transporter 1，MCT-1）。 小 膠 質 細 胞 外 泌 體 可 以 轉 移CD13至神經元，引起神經肽降解。小膠質細胞還可接收其他腦細胞分泌的外泌體。少突細胞祖細胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）來源的外泌體優(yōu)先被小膠質細胞通過大吞飲作用機制內化[26]。與初始小膠質細胞不同，被干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）刺激的小膠質細胞大幅減少對 OPCs來源的外泌體的吸收[26]。

6 MSC 來源的外泌體可能將應用于缺血性腦卒中的治療

包括骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）在內的細胞療法已被證明可改善卒中和腦外傷后神經功能。臨床前研究表明，MSCs促進血管生成，神經發(fā)生和腦白質重塑，通過分泌因子觸發(fā)參與腦修復的信號轉導通路。

體外培養(yǎng)的MSCs分泌大量的外泌體，通過調節(jié)大腦微環(huán)境改善了卒中和腦外傷的治療效果[27]。對局灶性腦缺血大鼠模型，靜脈注射MSCs來源的外泌體后，極大促進血管重塑，神經功能的改善[27]。MSCs 來源外泌體的全身給藥明顯降低缺血小鼠運動協(xié)調障礙，增強血管和神經再生，而人類MSCs來源外泌體治療腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）小鼠基本上保存其空間識別能力[28]。這些提示 MSCs介導的細胞間通訊的來源可能決定了MSCs的療效。

外泌體把其裝載的miRNA轉移給受體細胞。MSCs來源的外泌體含有超過 700 種 miRNA，他們與 Argonaute2（Ago2）結合，形成miRNA 誘導的沉默復合體。MSCs來源外泌體所裝載的特定miRNA水平對腦卒中后神經重塑的影響，已有體外和體內研究[27]。用 MSCs治療卒中模型動物，可以消除缺血性腦卒中誘導的 miR-133b 的水平下調[27]。將 MSCs與缺血腦組織提取物混合培養(yǎng)，MSCs釋放的 exosomes富含 miR-133b。慢病毒載體轉染 MSCs來源的外泌體可上調或下調外泌體中miR-133b水平。結締組織生長因子和 RhoA 是被 miR-133b 調控，并抑制軸突生長[27]。在體外，皮質神經元細胞與 miR-133b 上調的外泌體共培養(yǎng)，下調 RhoA 并促進軸突生長，星形膠質細胞與 miR-133b上調的外泌體共培養(yǎng)，則抑制結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達?？傊?，MSCs來源的外泌體可作為載體輸送miRNA至受體神經元和星形膠質細胞，從而調節(jié)其基因的表達。

卒中可抑制外周血免疫細胞的功能，導致卒中結局的惡化。除了與腦細胞之間的相互作用，MSCs來源的外泌體也可與卒中后小鼠外周血自然殺傷細胞和淋巴細胞進行相互作用，減輕缺血后免疫抑制[28]。

7 造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）來源的外泌體用于缺血性腦卒中的治療

來自心肌缺血的研究表明，CD34+HSC來源的外泌體，經人工修飾富含音猬因子（sonic hedgehog，SHH），可轉移功能化SHH至受體細胞并激活SHH信號通路，促進梗死邊緣區(qū)血管生成和保護心臟功能[29]。這些實驗表明，HSCs來源的外泌體，通過提供功能蛋白調節(jié)受體細胞的功能，很可能可促進腦卒中后的重塑。外泌體可穿越血腦屏障[30]。奧德賽 800 染料標記膠質母細胞瘤細胞分泌的外泌體并鼻腔給藥，可觀察到熒光顆粒分布于整個大腦，主要在小鼠嗅球[30]。利用 Cre-loxP 系統(tǒng)注射含Cre 重組酶 mRNA 的外泌體，至攜帶 ROSA26-lacZ 報告基因的小鼠海馬，在海馬神經元觀察到 LacZ 報告基因激活[22]，表明含Cre重組酶的外泌體激活了受體神經元的報告基因。

8 展望

越來越多的數(shù)據(jù)表明，外泌體是卒中后神經修復和神經損傷活動中重要的細胞間介質，有利于患者功能的恢復[31]。但仍然存在許多問題和挑戰(zhàn)：如需要明確卒中后腦組織及遠處器官以何種途徑來影響腦實質細胞外泌體的表達？外泌體裝載的內容物通過何種途徑來調節(jié)受體腦細胞的基因表達？不同腦實質細胞來源的外泌體其類型應如何劃分？以及不同性別、年齡和合并癥對外泌體及其裝載的內容物有何影響？今后的研究，通過探討外泌體作為缺血性腦細胞間的通訊介質，將有助于對卒中后神經功能修復機制的理解以及探索出基于外泌體的神經系統(tǒng)疾病的新療法。

[1]Gyorgy B,Hung ME,Breakefield XO,et al.Therapeutic applications of extracellular vesicles:clinical promise and open questions[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2015,55:439-464.

[2]Miyamoto N,Pham LD,Seo JH,et al.Crosstalk between cerebral endothelium and oligodendrocyte[J].Cell Mol Life Sci,2014,71:1055-1066.

[3]Yin KJ,Hamblin M,Chen YE.Angiogenesis-regulating microRNAs and Ischemic Stroke[J].Curr Vasc Pharmacol,2015,13:352-365.

[4]Buller B,Chopp M,Ueno Y,et al.Regulation of serum response factor by miRNA-200 and miRNA-9 modulates oligodendrocyte progenitor cell differentiation[J].Glia,2012,60:1906-1914.

[5]Gherardini L,Gennaro M,Pizzorusso T.Perile-sional treatment with chondroitinase ABC and motor training promote functional recovery after stroke in rats[J].Cereb Cortex,2015,25:202-212.

[6]Zhang Y,Chopp M,Liu XS,et al.MicroRNAs in the axon locally mediate the effects of chondroitin sulfate proteoglycans and cGMP on axonal growth[J].Dev Neurobiol,2015,75:1402-1419.

[7]He X,Yu Y,Awatramani R,et al.Unwrapping myelination by microRNAs[J].Neuroscientist,2012,18:45-55.

[8]Haqqani AS,Delaney CE,Tremblay TL,et al.Method for isolation and molecular characterization of extracellular microvesicles released from brain endothelial cells[J].Fluids Barriers CNS,2013,10:4-9.

[9]Yamamoto S,Niida S,Azuma E,et al.Inflammation-induced endothelial cell-derived extracellular vesicles modulate the cellular status of pericytes[J].Sci Rep,2015,5:8505-8514.

[10]Schulz GB,Wieland E,Wüstehube-Lausch J,et al.Cerebral cavernous malforma-tion-1 protein controls DLL4-Notch3 signaling between the endothelium and pericytes[J].Stroke,2015,46:1337-1343.

[11]Sheldon H Heikamp E,Turley H,et al.New mechanism for Notch signaling to endothelium at a distance bylike 4 incorporation into exosomes [J].Blood,2010,116:2385-2394.

[12]Pan W.Exosomes derived from ischemic cerebral endothelial cells and neural progenitor cells enhance neurogenesis and angiogenesis[J]. Stroke,2016,47:AWMP39.

[13]Ihrie RA,Alvarez-Buylla A.Lake-front property:a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain[J].Neuron,2011,70:674-686.

[14]Feliciano DM,Zhang S,Nasrallah CM,et al.Embryonic cerebrospinal fluid nanoves-icles carry evolutionarily conserved molecules and promote neural stem cell amplification[J].PLoS One,2014,9:e88810.

[15]Cossetti C,Iraci N,Mercer TR,et al.Extracellular vesicles from neural stem cells transfer IFN-gamma via Ifngr1 to activate Stat1 signaling in target cells[J].Mol Cell,2014,56:193-204.

[16]Higa GS,de Sousa E,Walter LT,et al.MicroRNAs in neuronal communication[J].Mol Neurobiol,2014,49:1309-1326.

[17]Lachenal G,Pernet-Gallay K,Chivet M,et al.Release of exosomes from differentiated neurons and its regulation by synaptic glutamatergic activity[J].Mol Cell Neurosci,2011,46:409-418.

[18]Goncalves MB,Malmqvist T,Clarke E,et al.Neuronal RARβ signaling modulates PTEN activity directly in neurons and via exosome transfer in astrocytes to prevent glial scar formation and induce spinal cord regenera-tion[J].J Neurosci,2015,35:15731-15745.

[19]Morel L,Regan M,Higashimori H,et al.Neuronal exosomal miRNA-dependent translational regulation of astro-glial glutamate transporter GLT1 [J].J Biol Chem,2013,288:7105-7116.

[20]Clarkson AN,Overman JJ,Zhong S,et al.AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke[J].J Neurosci,2011,31:3766-3775.

[21]Wang S,Cesca F,Loers G,et al.Synapsin I is an oligomannose-carrying glycoprotein,acts as an oligomannose-binding lectin,and promotes neurite outgrowth and neuronal survival when released via glia-derived exosomes[J].J Neurosci,2011,31:7275-7290.

[22]Fruhbeis C,Fr?hlich D,Kuo WP,et al.Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligoden-drocyte-neuron communication[J]. PLoS Biol,2013,11:e1001604.

[23]Bakhti M,Winter C,Simons M.Inhibition of myelin membrane sheath formation by oligo-dendrocyte-derived exosome-like vesicles[J].J Biol Chem,2011,286:787-796.

[24]Fruhbeis C,Frohlich D,Kuo WP,et al.Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication[J].Front Cell Neurosci,2013,7:182-189.

[25]Frohlich D,Kuo WP,Frühbeis C,et al.Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons:impact on neuronal firing rate,signal transduction and gene regulation[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2014,369:2013510.

[26]Fitzner D,Schnaars M,van Rossum D,et al.Selective transfer of exosomes from oligodendrocytes to microglia by macropi-nocytosis[J].J Cell Sci,2011,124:447-458.

[27]Xin H,Li Y,Liu Z,et al.MiR-133b promotes neural plasticity and functional recovery after treatment of stroke with multipotent mesenchymal stromal cells in rats via transfer of exosome-enriched extracellular particles[J].Stem Cells,2013,31:2737-2746.

[28]Doeppner TR,Herz J,G?rgens A,et al.Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression[J].Stem Cells Transl Med,2015,4:1131-1143.

[29]Mackie AR,Klyachko E,Thorne T,et al.Sonic hedgehog-modified human CD34+cells preserve cardiac function after acute myocardial infarction[J].Circ Res,2012,111:312-321.

[30]Zhuang X,Xiang X,Grizzle W,et al.Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain[J].Mol Ther,2011,19:1769-1779.

[31]Ueno Y,Chopp M,Zhang L,et al.Axonal outgrowth and dendritic plas-ticity in the cortical peri-infarct area after experi-mental stroke[J]. Stroke,2012,43:2221-2228.

（本文編輯：唐穎馨）

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.014

復旦附屬浦東醫(yī)院/上海市浦東醫(yī)院a.急診內科；b.全科醫(yī)學科；c.內分泌科上海 201399

2017-02-10

蕭文澤wenzexiao@yahoo. com

注：瞿笑豐和陳麗欣為并列第一作者