肖偉++++++馬篤軍++++++彭力平++++++王立新++++++余闐++++++廖州偉++++++陳達(dá)++++++譚銳泉

[摘要] 目的 觀察牛膝醇提物對兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞體外增殖及對糖胺聚糖（GAG）形成的影響。 方法 骨關(guān)節(jié)炎造模成功后提取、分離兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，用甲苯胺藍(lán)染色確定軟骨細(xì)胞的存在，將軟骨細(xì)胞接種于5組：空白對照組、牛膝醇提物低劑量組、牛膝醇提物中劑量組、牛膝醇提物高劑量組、經(jīng)典軟骨增殖組。倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)，用CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞增殖率，免疫細(xì)胞學(xué)檢測Ⅱ型膠原蛋白熒光表達(dá)，qRT-PCR檢測軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平，鄰聯(lián)甲苯胺（DMB）染色法檢測細(xì)胞內(nèi)GAG含量。 結(jié)果 牛膝醇提物高、中、低劑量組與空白對照組比較Ⅱ型膠原蛋白熒光明顯陽性表達(dá)；牛膝醇提物高、中劑量組與空白對照組比較軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因Ⅱ型膠原mRNA明顯增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組效果最佳（P < 0.01），與經(jīng)典軟骨增殖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；空白對照組GAG含量與經(jīng)典軟骨增殖組及不同劑量牛膝醇提物組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高劑量組與經(jīng)典軟骨增殖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 牛膝醇提物中藥含藥血清可促進(jìn)體外軟骨細(xì)胞的增殖和蛋白合成，具體作用機制有待進(jìn)一步探討。

[關(guān)鍵詞] 牛膝醇提物；軟骨細(xì)胞；骨關(guān)節(jié)炎；增殖；糖胺聚糖

[中圖分類號] R684.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0020-05

[Abstract] Objective To observe the effects of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae on the proliferation in vitro and glycosaminoglycan （GAG） formation of chondrocytes in rabbits with osteoarthritis. Methods After successful establishment of osteoarthritis model， the chondrocytes in rabbits with osteoarthritis were extracted and separated， the exit of chondrocytes was determined by toluidine blue staining， the chondrocytes were inoculated into five groups： blank control group， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group， classic cartilage proliferation group. The cellular morphology of chondrocytes was observed by inverted phase contrast microscope， the proliferation rates of chondrocytes were detected by CCK-8 method， the fluorescent expression of type Ⅱ collagen was detected by immunocytology， the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA was detected by qRT-PCR， the contents of intracellular GAG were detected by DMB staining method. Results Compared with the blank group， fluorescent expression of type Ⅱ collagen in high， median， low dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were positive； the expression of chondrocyte marker gene type Ⅱ collagen mRNA in high， median dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups were significantly increased compared with that of blank control group （P < 0.05）， among which， the effect of high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was the best （P < 0.01）， which had no significant differences compared with that of classic cartilage proliferation group （P > 0.05）； the content of GAG in blank control group had significant differences compared with those of classic cartilage proliferation group and different dosages of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae groups （P < 0.05）， among which， the content of GAG in high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group was at most （P < 0.01）， there was no significant difference between high dosage of alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae group and classic cartilage proliferation group （P > 0.05）. Conclusion Serum containing alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae can promote the proliferation and protein synthesis of chondrocytes in vitro， the specific mechanism needs to be further studied.

[Key words] Alcohol extractive of Radix Achyranthis Bidentatae； Chondrocyte； Osteoarthritis； Proliferation； Glycosaminoglycan

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis）的核心病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的軟化、破潰和脫落[1]，給社會帶來了巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，亟待研究解決。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分，是軟骨破壞過程中的靶細(xì)胞，因此軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究關(guān)節(jié)軟骨生理及病理的常用體外實驗?zāi)Ｐ蚚2]。通過對古方和專業(yè)雜志的統(tǒng)計[3-4]，在治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥中，牛膝的使用頻率最高，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)[1，5]，牛膝在體內(nèi)能明顯促進(jìn)兔骨關(guān)節(jié)炎和急性軟骨損傷模型軟骨細(xì)胞增殖，提高軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)。故本研究擬在體外研究牛膝醇提物含藥血清共培養(yǎng)干預(yù)兔軟骨細(xì)胞的增殖及促進(jìn)糖胺聚糖（glycos？鄄aminoglycan，GAG）的形成作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下： 1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM∶F12（1∶1）（HyClone）；倒置相差顯微鏡（Leica）；胎牛血清（FBS，Gibico）；10%甲醛標(biāo)本固定液（福爾馬林液）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus）；IGF-1（Peprotech）；bFGF（Peprotech）；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（Gibco）；CCK-8試劑盒（C0037，碧云天）；TRE-Trizol（Invitrogen）；Primers（上海生工）；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）；BSA（牛血清蛋白，sigma）；Collagen Ⅱ抗體（（ab3092），abcam）；Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（廣州易錦生物技術(shù)有限公司）；DAPI染液（碧云天生物研究所）；抗熒光衰減封片劑（碧云天生物研究所）；倒置熒光顯微鏡（DMI6000B，Leica）；85-2控溫磁力攪拌器（XMTD-701，金壇市醫(yī)療器械廠）；牛膝醇提物（懷牛膝，深圳市中醫(yī)院藥劑科）等。

1.2 實驗動物

健康新西蘭兔56只，兔齡1～2個月，體重1.0～1.5 kg，雌雄不限，由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供[動物合格證號：SCXK（粵）2014-0035]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗分組，隨機將動物分配至空白對照組（4只）、骨關(guān)節(jié)炎模型組（52只）。造模6周后從骨關(guān)節(jié)炎模型組隨機抽取4只實驗兔與空白對照組4只兔進(jìn)行比較，驗證骨關(guān)節(jié)炎造模是否成功，再將48只骨關(guān)節(jié)炎模型組實驗兔分為骨關(guān)節(jié)炎模型對照組、骨關(guān)節(jié)炎模型高劑量組、骨關(guān)節(jié)炎模型中劑量組、骨關(guān)節(jié)炎模型低劑量組，各12只。實驗地址：深圳市中醫(yī)藥研究所，實驗操作符合2006年中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨關(guān)節(jié)炎動物造模、鑒定 按照馬氏骨關(guān)節(jié)炎造模方法行實驗兔右膝關(guān)節(jié)向前伸直位管型石膏固定，石膏外層纏繃帶，肢體不用棉墊包裹，防止石膏易脫落，每天記錄實驗兔肢端血液循環(huán)、固定石膏穩(wěn)定度、活動量等情況，固定6周后行骨關(guān)節(jié)炎模型鑒定[6]。

1.3.2 牛膝醇提物含藥血清制備 《中國藥典》2010年版牛膝常規(guī)高用量12 g，按照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量進(jìn)行換算，實驗兔每日用量約1 g/kg。按照常規(guī)用藥量的1、3、6倍，予骨關(guān)節(jié)炎模型低劑量組1 g/（kg·d）、骨關(guān)節(jié)炎模型中劑量組3 g/（kg·d）、骨關(guān)節(jié)炎模型高劑量組6 g/（kg·d），骨關(guān)節(jié)炎模型對照組0 g/（kg·d），每天灌胃2次，連續(xù)6周，每次灌胃時用蒸餾水配成10 mL。上述實驗動物最后1次灌胃后2 h靜脈采血，經(jīng)滅活、過濾后分別配成10%含藥血清DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液和10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)液。

1.3.3 軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng) 實驗兔麻醉后，無菌切取骨關(guān)節(jié)炎模型對照組關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)沖洗、剪碎、蛋白酶消化后收集離心得到的軟骨細(xì)胞團塊后，加入培養(yǎng)液稀釋制成單細(xì)胞懸液并行原代培養(yǎng)。細(xì)胞爬片后用甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞的存在。待細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時消化傳代，以倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞形態(tài)，利用CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞增殖，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm雙波長處測得相應(yīng)OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.4 軟骨細(xì)胞體外分組培養(yǎng)、含藥血清干預(yù) 取第2代軟骨細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液中培養(yǎng)培養(yǎng)1周，換液2次。從第2周起隨機用牛膝醇提物不同劑量組10%含藥血清、10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液和含胰島素樣生長因子-1（IGF-1）10 ng/mL+堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）10 ng/mL 10%空白血清DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2周，每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并攝片。分別于誘導(dǎo)的第3、6、9、12天進(jìn)行CCK-8檢測，方法同上。具體分組如下，空白對照組：10%胎牛血清+10%空白血清+DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液；牛膝醇提物高劑量組：10%胎牛血清+10%高劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液；牛膝醇提物中劑量組：10%胎牛血清+10%中劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液；牛膝醇提物低劑量組：10%胎牛血清+10%低劑量含藥血清+DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液；經(jīng)典軟骨增殖組：10%胎牛血清+10%空白血清+IGF-1 10 ng/mL+bFGF 10 ng/mL + DMEM∶F12（1∶1）培養(yǎng)液。

1.3.5 免疫細(xì)胞學(xué)檢測Ⅱ型膠原蛋白熒光表達(dá) 制備空白對照組及實驗組細(xì)胞爬片，按照免疫組化試劑盒說明添加抗體，然后顯色，脫水，透明，封片，計算陽性率。

1.4 qRT-PCR引物設(shè)計、檢測軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)

采用Primer 3.0設(shè)計Real Time PCR引物，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對無非特異性擴增，用于qRT-PCR實驗。該實驗?zāi)康幕颌蛐湍z原（ID100009005）引物序列（5' to 3'）：Forward TGTGAACTGGTAGATCTGGT；Reverse AAGAAGTGGAATAAGTGGGCT。分別收集空白對照組與實驗組細(xì)胞，將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，提取軟骨細(xì)胞總RNA，再用隨機引物，逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此cDNA第1鏈為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴增。

1.5 GAG含量測定

使用DMB染色法試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)GAG含量，使用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞。首先測定吸光值：細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，加入DMB顯色劑，于525 nm波長處比色，測定吸光值；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：硫酸軟骨素作標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入DMB顯色劑，測定吸光值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。兩組曲線相互對比，求出GAG濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，不滿足方差分析時用非參數(shù)檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及增殖曲線

原代細(xì)胞剛接種時形態(tài)主要為梭形或圓形，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開始貼壁生長，48 h后基本全部貼壁生長，分布稀疏。培養(yǎng)3～4 d后細(xì)胞增殖加快，體型呈多邊形（圖1）。隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞增殖活性下降，形態(tài)多樣，傳至P5后軟骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞碎片增多、形態(tài)扁平等老化現(xiàn)象，增殖減慢。選擇CCK-8法觀察P1、P3、P5傳代細(xì)胞生長曲線，繪制的生長曲線符合Logistic生長曲線規(guī)律。傳代第1～2天為生長潛伏期，第3～6天為對數(shù)增殖期，對數(shù)增殖期結(jié)束后進(jìn)入平臺期和下降期。P1～P3代細(xì)胞增殖能力基本相同，P5代細(xì)胞生長速度略低于P3。細(xì)胞的增殖能力隨傳代次數(shù)增加而開始減弱（圖2）。

2.2 免疫細(xì)胞學(xué)檢測軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)

連續(xù)培養(yǎng)14 d后，空白對照組（圖3a，封四）輕度Ⅱ型膠原熒光染色，牛膝醇提物高劑量組（圖3b，封四）和經(jīng)典軟骨增殖組（圖3c，封四）Ⅱ型膠原熒光染色明顯陽性，說明經(jīng)典軟骨增殖組和牛膝醇提物高劑量組軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原蛋白明顯表達(dá)。

2.3 軟骨細(xì)胞qRT-PCR結(jié)果

qRT-PCR檢測結(jié)果分析表明，與空白對照組比較，牛膝醇提物高、中劑量組及經(jīng)典軟骨增殖組軟骨標(biāo)記基因Ⅱ型膠原表達(dá)量均明顯增加（P < 0.05），其中牛膝醇提物高劑量組軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因Ⅱ型膠原表達(dá)量最多（P < 0.01）。牛膝醇提物低劑量組Ⅱ型膠原表達(dá)量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

2.4 軟骨細(xì)胞GAG含量測定

空白對照組GAG含量與經(jīng)典軟骨增殖組及不同劑量牛膝醇提物組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其中高劑量組GAG最多（P < 0.01），牛膝醇提物高劑量組與經(jīng)典軟骨增殖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖5。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨受組織學(xué)和生物學(xué)特性的限制，骨組織中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞不能進(jìn)入損傷部位，軟骨破壞后自然修復(fù)的組織為纖維軟骨，缺乏原正常透明軟骨的耐用性及力學(xué)功能，如何修復(fù)病損的關(guān)節(jié)軟骨是目前骨關(guān)節(jié)炎研究的重點和難點。

組織工程利用中藥修復(fù)組織損傷性疾病的研究逐年增加，一些補肝腎、強筋骨類中藥能夠促進(jìn)軟骨的形成[8-10]，而牛膝是治療軟骨損傷性疾病如骨關(guān)節(jié)炎的使用頻率最高的中藥。牛膝有效成分有多糖類、皂苷類、甾酮類、黃酮類等，與其“補肝腎，強筋骨”功效相關(guān)的研究有：多糖類具抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用[11]，汪巍[7]研究證實多糖類具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成GAG的作用，與本研究結(jié)果相符合，皂苷類具有促進(jìn)軟骨增殖的作用，蛻皮甾酮具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、使受損細(xì)胞再生等作用，乙醇提取物能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，增加Ⅱ型膠原表達(dá)[12]，與本研究體外培養(yǎng)有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原表達(dá)相符合。

多種信號通路參與軟骨細(xì)胞生長、成熟過程。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是細(xì)胞的能量感受器，可通過感受能量變化（AMP上升，ATP下降）的程度而被激活。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路在軟骨細(xì)胞成熟、增殖、凋亡等方面起著重要作用，并對軟骨外基質(zhì)分解代謝亦有著重要的作用，可通過環(huán)氧化酶（COX-2）、白細(xì)胞介素（IL）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）值變化來影響軟骨代謝。本研究過程中牛膝醇提物組有效促進(jìn)了軟骨細(xì)胞體外增殖，軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光強表達(dá)，并且GAG分泌量明顯增多，因此Wnt/β-catenin通路很可能參與其中。陳達(dá)等[13]用牛膝醇提物對兔骨關(guān)節(jié)炎模型灌胃后發(fā)現(xiàn)，牛膝醇提物組較空白對照組能明顯降低血液和關(guān)節(jié)液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β及MMP-3等炎癥介質(zhì)的含量。因此認(rèn)為Wnt/β-catenin信號通路是骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞病程中最重要的信號通路之一，也可能是牛膝醇提物有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用機制之一。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)來參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等多種細(xì)胞的生理過程，是胞外信號引起細(xì)胞核反應(yīng)的共同通路。MAPK被證實在炎癥因子引起軟骨細(xì)胞MMPs表達(dá)增高的過程中起了重要作用。馬鋼等[14]報道，Caspase-3蛋白在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡過程中扮演著重要的作用。同樣PI3K/Akt信號途徑的正常表達(dá)對軟骨細(xì)胞的增殖、分化也具有不可替代的作用[15]。由此可見，軟骨增殖、成熟的過程中，有多條信號通路參與其中，這些信號通路互相交織，在軟骨細(xì)胞增殖的進(jìn)程擔(dān)負(fù)著不同的作用。

中藥構(gòu)建軟骨組織工程的研究是一個嶄新的研究領(lǐng)域，許多中藥（包括牛膝）能夠有效地參與成骨活動，并有較高的誘導(dǎo)率、安全性，其中牛膝醇提物屬于單味中藥懷牛膝的濃縮醇提物混合制劑，含有牛膝多種有效成分，具有“組合分化”的特性，比單體藥物制劑作用更加廣泛。研究表明，多糖類具有激活p38MAPK信號通路上調(diào)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的作用[16]；皂苷類具有降低Wnt通路β-catenin蛋白的磷酸化來下調(diào)β-catenin mRNA的表達(dá)和抑制

Wnt信號通路，下調(diào)TGF-β1表達(dá)發(fā)揮抑制系膜細(xì)胞增殖[17]；甾酮類可通過激活ERK/MAPK信號通路增加細(xì)胞抗氧化作用而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖[18]；黃酮類能調(diào)控抑制Wnt通路β-catenin蛋白來改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織炎癥狀態(tài)[19]，以及通過抑制AMPK通路NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平降低而抑制炎癥因子IL-6的分泌[20]。因此，進(jìn)一步研究這種信號通路相互作用的生物網(wǎng)絡(luò)機制，明確牛膝醇提物在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖中，不同分子對其作用的機制，將有助于我們找到治療骨關(guān)節(jié)炎的靶點，AMPK/Wnt/MAPK信號通路串話可能是牛膝醇提物對骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)作用的信號交互通路之一。

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