任冠恒 ，翁榕花 ，施 妍 ，黃 平 ，李正東 ，邵 煜 ，鄧愷飛 ，劉寧國 ，陳憶九

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；2.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510515；3.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 351100）

·綜 述·

MALDI-TOF-IMS在生物醫(yī)學中的研究進展及法醫(yī)學應用展望

任冠恒1，2，翁榕花3，施 妍1，黃 平1，李正東1，邵 煜1，鄧愷飛1，劉寧國1，陳憶九1

（1.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；2.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510515；3.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 351100）

基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術通過對生物組織切片的掃描，分析切片中的未知組分，獲取組織的分子成像圖，已成為研究生物標志物、脂類分布、藥物代謝等方面的有力手段。本文對該技術在蛋白質鑒定、臨床應用、藥物研發(fā)、脂類研究及腦損傷方面的應用進行了綜述。

法醫(yī)病理學；質譜成像；綜述；基質輔助激光解吸電離

基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術是一門新興的分子成像技術，主要用于人類和動物組織切片中的蛋白質研究，特別是在病理機理研究中的應用，對法醫(yī)病理學的發(fā)展前景有極大的推動作用。此外，MALDI-TOF-IMS還可用于藥物研發(fā)，當藥物作用于病變組織，可跟蹤特定藥物及其代謝物在組織中的空間分布，揭示化合物如何在不同組織中發(fā)揮作用。MALDI-TOF-IMS在脂質組學方面也有大量的研究，并取得了一定的進展。本文對該技術在蛋白質鑒定、臨床應用、藥物研發(fā)、脂類研究以及腦損傷方面的應用進行綜述。

1 蛋白質的鑒定

鑒定組織中的差異蛋白和多肽有利于闡明基礎疾病的生物學過程。通過對MALDI-TOF-IMS分析獲得的原始質譜圖進行加工處理和統(tǒng)計學分析后，得到組織中所有差異表達的質譜峰列表（按m/z排列），這些差異峰所對應的多肽和蛋白可能在疾病發(fā)展進程中起到顯著的調節(jié)作用，因此，鑒定這些多肽和蛋白對于闡明法醫(yī)病理學機制有非常重要的意義。而蛋白質的鑒定方法會因樣品的復雜性、蛋白質豐度或分子量而不同。目前最常用的方法有兩種，即自底向上策略和自頂向下策略。在自底向上策略中，純化的蛋白質或者復雜的蛋白質混合物被酶切為肽段，隨后使用色譜分離肽段混合物，并對肽段混合物進行質譜分析[1]。在自頂向下策略中，完整的蛋白質分子被作為一個整體進行質譜分析[2]。一般情況下，自頂向下策略多應用于分析相對分子質量較小的蛋白質，因為相對分子質量大于100 000的蛋白質碰撞誘導碎裂通常是不充分的。自底向上策略多用于分析復雜的樣品混合物，常常需要對蛋白質水解得到的肽段混合物進行碰撞誘導碎裂，然后進行串聯(lián)質譜分析。蛋白質鑒定數(shù)據(jù)處理方法可以分為三類，即數(shù)據(jù)庫搜索方法、從頭測序方法和肽序列標簽方法。其中數(shù)據(jù)庫搜索是應用最廣泛的方法，一般包括三步：圖譜處理、候選肽段生成和實驗-理論圖譜比對。數(shù)據(jù)庫搜索可借助商業(yè)軟件SEQUEST和MASCOT[3]來完成。

MALDI-TOF-IMS直接獲得不同分子量的物質在組織切片上的分布信息，對于相對分子質量較大的蛋白，難以直接通過串聯(lián)質譜法（MS/MS）分析鑒定。原位酶切技術是將酶液微滴點在組織切片上，在室溫下將蛋白質在其原位酶切成若干肽段的一項新技術。該技術可通過對酶切后肽段的MS/MS分析，鑒定其所屬蛋白質[4]。這種原位鑒定蛋白質的方法與傳統(tǒng)的蛋白質分離鑒定方法相比更省時間，同時將蛋白質直接成像分析結果與相同蛋白質的多肽分布特征相比對，若兩者結果一致，則表明蛋白質在酶切過程中位置未發(fā)生變化，原位酶切技術提高了蛋白質的鑒定成功率。最后，可以通過免疫組織化學等方法，采用特異的抗體對鑒定的蛋白質進行驗證。發(fā)現(xiàn)新的生物標志物一直是廣大的法醫(yī)病理學者致力的方向，MALDI-TOFIMS技術的出現(xiàn)將為法醫(yī)病理學提供一條新的思路。

2 在臨床研究中的應用

醫(yī)學影像技術已經(jīng)成為臨床診斷的必備手段，但是絕大部分不能在分子水平上提供組織成分的分布信息，而質譜成像技術能在分子水平上發(fā)現(xiàn)病變組織的標志物，因此在臨床診斷上具有較好的應用前景。目前，MALDI-TOF-IMS已用于多種疾病的診斷，包括阿爾茨海默病[5]、人類非小細胞肺癌[6]、神經(jīng)膠質瘤[7]、霍奇金淋巴瘤[8]和胃腸道的癌前病變[9]等。疾病發(fā)生過程涉及眾多細胞事件，而蛋白質是眾多細胞事件的執(zhí)行者。任何疾病的發(fā)生發(fā)展過程蛋白質都會發(fā)生不同變化，如腫瘤在其發(fā)展過程中蛋白質發(fā)生異常變化，并涉及蛋白質表達量的增減、翻譯后加工的改變等，從而導致腫瘤表達的蛋白質譜發(fā)生改變。最常用的是比較蛋白質組學的方法，找出具有顯著性差異的m/z位點，鑒定出與病情發(fā)展相關聯(lián)的特定蛋白質分子。在某些研究中，實驗的目的是鑒定與疾病發(fā)展相關的特殊分子，如膠質瘤或非小細胞肺癌的蛋白質分子特征能用于辨別腫瘤級別并與患者的存活率關聯(lián)[10]。MALDI-TOF-IMS在尋找生物標志物方面的作用已廣泛應用于臨床并取得不錯的發(fā)展。YE等[11]展示了MALDI-TOF-IMS在臨床應用中的多功能性，如生物標志物用于各種疾病的診斷、疾病嚴重程度的預測以及體內藥物的代謝反應等。隨著MALDI-TOFIMS技術的不斷發(fā)展，人們將會對生物學疾病有更深刻的認識，并且在臨床診斷中的應用進一步推進。通過蛋白水平的監(jiān)測，不僅可以暴露疾病的類型，還能暴露疾病的嚴重程度，特別是發(fā)現(xiàn)癌前病變。MEDING等[12]利用MALDI質譜成像技術成功將六種常見的癌癥探測出來，包括與巴雷特食管相關的食管癌、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌、胃癌和甲狀腺癌。研究者們利用MALDI-TOF-IMS建立各種已知癌癥類型的不同蛋白分子標志物的數(shù)據(jù)庫，根據(jù)其蛋白質組學的差異性，將癌癥細胞特定的圖譜提取出來并進行分類，獲得了很高的可信性。

3 在藥物研發(fā)中的應用

藥物研發(fā)的關鍵在于識別正確的藥理學靶點，藥物能否到達作用部位有助于研究者們更好地評定化學物作為醫(yī)藥產(chǎn)品的潛在價值和產(chǎn)生的毒理效應[13]。MALDI-TOF-IMS技術使直接測定組織切片上的藥物分布成為可能，這也許能闡明新藥開發(fā)過程中藥物處置或生物轉化的途徑。很多化合物的相對分子質量小于1000，屬于小分子化合物一類，具有生理和藥理上的相關性[14]。藥物研發(fā)的常用方法是將藥物用放射性同位素標記，運用放射自顯影技術研究受體的分布和數(shù)量。放射自顯影技術是將放射性同位素標記的藥物給予動物口服，然后將動物處死，將組織進行切片并放于暗盒內曝光，觀察放射性藥物在細胞內外分布的情況。相較于放射自顯影技術，MALDI-TOF-IMS不需要使用放射性同位素標記藥物，這在藥物開發(fā)初期有明顯的優(yōu)勢，因為將大量需要被篩選的藥物進行放射性標記是非常耗時的工作。此外，MALDI-TOFIMS能夠區(qū)分藥物與其代謝物，而放射自顯影技術則不能有效區(qū)分放射線是來自藥物還是其代謝物。放射自顯影技術另一個缺點是不能同時獲得組織內藥物的時間、空間分布信息，在進行劑量估算時，只能獲得某一時點的劑量率。MALDI-TOF-IMS在空間分辨率達100μm下能同時測定多種藥物在組織切片上的分布情況[15]。盡管MALDI-TOF-IMS一般只用于生物聚合物的分析，但將這種技術用于小分子（相對分子質量＜1 500）的定性和定量分析具有良好的潛能[16]。MALDI-TOF-IMS用于小分子的研究多見于藥物活性化合物及其代謝物的分析，如有報道[17]研究藥物奧氮平及其代謝物在整個大鼠切片中的分布，該研究結果與放射自顯影和LC-MS/MS定量結果具有很好的相關性，展示了MALDI-TOF-IMS用于代謝物研究的可行性。

4 在脂質組學方面的應用

脂質組學是研究一個生物體內所有脂類分子的特性，以及其在蛋白質表達和基因表達調節(jié)過程中的作用，是生物標志物研究的前沿方向之一[18]。氣相層析-質譜技術用于脂類的分析已經(jīng)有數(shù)十年歷史。氣相層析分析脂類分子的首要條件是這些脂類分子必須氣化，由于很多脂類分子是非揮發(fā)性的，所以化學修飾使脂類分子氣化是此方法必不可少的一步。MALDI技術的發(fā)展使得脂類的質譜分析發(fā)生了巨大的改變，脂類的揮發(fā)性問題不再如以前那么突出，脂類可以直接采用MALDI電離后進入質譜儀進行MS和MS/MS分析，這使得脂類的鑒定能夠快速、高通量和精確地進行并極大地推動脂質組學的研究。MALDI-TOFIMS分析法主要有兩種，一種是溶劑提取法[19]，另一種是組織切片直接分析法[20]。溶劑提取法是采用簡單易操作的全脂類提取方法，然后用MALDI-TOF-IMS直接進行分析。組織切片直接分析法是用MALDITOF-IMS直接分析組織樣品中脂類的分布，通過對健康和疾病組織的質譜圖對比分析，可以直接對其中的差異脂類進行定性鑒定。MALDI-TOF-IMS用于脂類分子的成像研究，不僅可以獲得完整和精確的結構圖，而且能在組織切片處理和破壞程度減到最低的情況下跟蹤組織切片中脂質分子的分布。利用MALDITOF-IMS技術，研究人員已對小鼠大腦中的卵磷脂[21]、神經(jīng)節(jié)糖苷[22]、硫酸酯[23]和腦苷脂類[24]等脂類分子的分布進行了研究。也有研究者[25]利用離子遷移率的方法結合MALDI-TOF-MS用于脂質分子的分離。在該技術中，首先以離子遷移率的方法分離離子，然后通過MALDI-TOF-IMS技術進行分析，被解吸出來的脂質離子沿著特定的軌道飛行，實現(xiàn)與具有相同相對質量的寡核苷酸、多肽、蛋白質和藥物及其代謝物的分離，這有利于將來自脂質的離子與其他小分子物質進行區(qū)分。

5 在腦損傷研究中的應用

目前，MALDI-TOF-IMS用于腦損傷中的研究相對較少。HANKIN等[26]利用MALDI-TOF-IMS技術觀察腦缺血-再灌注損傷實驗模型的大鼠海馬區(qū)域，特別是CA1區(qū)域中磷脂分子的分布。與對照組比較，腦缺血-再灌注損傷大鼠的海馬區(qū)域可見質荷比（m/z）為548.5的離子豐度大幅度增加，通過碰撞誘導裂解技術鑒定該離子與神經(jīng)酰胺有關，而神經(jīng)酰胺是一種與細胞凋亡相關的脂質。該研究還利用MALDI-TOFIMS觀察了外傷性腦損傷實驗模型的大鼠，發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)域神經(jīng)酰胺的表達增多，同時磷酸膽堿鉀加合物信號顯著丟失，并出現(xiàn)相應的鈉加合物離子信號的增強，這種改變是腦水腫導致的結果，原因是損傷造成Na/K-ATP酶的失活，使細胞外液流入細胞。該研究展示了MALDI-TOF-IMS在檢測脂質在組織中生化改變方面的應用前景，以及為組織損傷相關生化機制的闡明提供數(shù)據(jù)支持。此外，SHANTA等[27]通過MALDI質譜成像技術檢測大鼠腦缺血損傷模型腦組織中的磷脂質，比較對照組和損傷組腦組織中磷脂質的分布，利用MALDI質譜成像技術及MS/MS進行分析，鑒定腦組織中磷脂質的變化情況，與正常腦組織相比，腦缺血損傷的腦組織中有11種表達上調的磷脂質，包括溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂鈉加合物和卵磷脂鈉加合物。與此同時，有7種卵磷脂表達下調，包括卵磷脂鉀加合物、鞘磷脂鉀加合物和溶血卵磷脂鉀加合物。該研究通過MALDI-TOF-IMS技術對磷脂質的鑒定，發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷腦組織中的磷脂生物標志物有利于研究腦缺血損傷的機制。顱腦損傷是法醫(yī)病理學實踐重要的內容之一，能夠利用MALDI-TOF-IMS對顱腦損傷生物標志物進行篩選和鑒定，為法醫(yī)病理學的發(fā)展提供很大的幫助。

6 展 望

MALDI-TOF-IMS技術用于生物組織切片是一種新興的分子成像技術，通過對組織切片的掃描，能夠同時檢測組織切片中多種未知的分子成分，結合分析軟件可篩選出有統(tǒng)計學意義的差異分子峰，并可對這些分子峰進行定性分析，提供這些分子在組織中的空間分布信息。MALDI-TOF-IMS技術現(xiàn)已廣泛應用于生物醫(yī)學領域。而目前該技術在法醫(yī)病理學中的應用還比較少，但其在法醫(yī)病理學中的發(fā)展前景是非常誘人的。因其在蛋白質、多肽以及脂質等分子的定性和空間分布方面有著獨特的優(yōu)勢，將在法醫(yī)病理學研究中發(fā)揮很大的功能。

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2016-04-06）

（本文編輯：張建華）

Research Progress of MALDI-TOF-IMS in Biomedicine and Its Application Prospect in Forensic Sciences

REN Guan-heng1,2,WENG Rong-hua3,SHI Yan1,HUANG Ping1,LI Zheng-dong1,SHAO Yu1,DENG Kaifei1,LIU Ning-guo1,CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Science,School of Basic Medicine Science,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Chengxiang Branch of Putian Public Security Bureau,Putian 351100,China）

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight imaging mass spectrometry （MALDITOF-IMS）can analysis unknown compounds in sections and obtain molecule imaging by scanning biological tissue sections,which has become a powerful tool for the research of biomarker,lipid distribution and drug metabolism,etc.This article reviews the application of this technique in protein identification,clinical application,drug discovery,lipid research and brain injury.

forensic pathology;imaging mass spectrometry;review;matrix-assisted laser desorption;ionization

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.016

1004-5619（2017）05-0522-04

國家自然科學基金資助項目（81571851）；中央級科研院所科研專項（GY2015G-2、GY2013Z-3）；上海市科委社會發(fā)展專項（14231202500）

任冠恒（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：rgh_0101@163.com

劉寧國，男，研究員，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：liuningguo@foxmail.com

通信作者：陳憶九，男，研究員，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：chenyj@ssfid.cn