李興國，溫漢春

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的研究進(jìn)展

李興國，溫漢春

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種重要的革蘭陰性條件致病菌，近年來由于各種抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致其形成了多重耐藥菌和泛耐藥菌。目前對于該菌外膜蛋白的研究相對較少。鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)的外膜蛋白，包括外膜蛋白A、外膜蛋白33-36、外膜蛋白W、外膜蛋白22、外膜蛋白AIS-1969等均為鮑曼不動(dòng)桿菌致病毒力因子。外膜蛋白眾多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，研究這些外膜蛋白將會有利于人類找到合適的靶點(diǎn)構(gòu)建疫苗，為人類的抗感染治療增加新的手段。

鮑曼不動(dòng)桿菌；外膜蛋白；細(xì)菌耐藥性

鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)是一種需氧、不發(fā)酵，能夠在不同環(huán)境中存活的條件致病菌。上個(gè)世紀(jì)90年代以前，AB對多數(shù)抗生素敏感且對人類無致病性。然而進(jìn)入21世紀(jì)，人們發(fā)現(xiàn)AB可以引起多種院內(nèi)感染性疾病如呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、菌血癥、腦膜炎等。雖然很多學(xué)者對于AB流行病學(xué)、耐藥機(jī)制等研究做了很大貢獻(xiàn)，但對于其致病機(jī)制、表面蛋白及疫苗學(xué)的研究卻相對較少。本文就AB外膜蛋白的研究進(jìn)行以下綜述。

1 膜蛋白A(OmpA)

OmpA是目前研究最為深入的AB致病毒力因子。該蛋白有多種功能，不僅可以促進(jìn)菌體對宿主細(xì)胞的黏附、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可以刺激宿主的免疫反應(yīng)。

1.1 OmpA的毒力效應(yīng) OmpA是一種低通透性孔蛋白。AB的OmpA屬于多聚合孔蛋白家族中的單聚體外膜孔蛋白[1]，與大腸桿菌OmpA和銅綠假單胞菌的OmpF相似，具有轉(zhuǎn)運(yùn)小分子物質(zhì)的功能。Lopes等[2]研究發(fā)現(xiàn)，AB的OmpA在細(xì)菌細(xì)胞膜表面所形成的孔道直徑約為2 nm，僅為大腸桿菌OmpF的1/70，說明OmpA所形成的孔道非常微小，因此其通透性較低。雖然OmpA孔道微小，但當(dāng)OmpA基因被敲除后，基因缺失菌膜通透性降低[2]。這一研究表明OmpA是AB表面非常重要的孔道蛋白。

OmpA在菌體黏附和侵襲宿主細(xì)胞過程中扮演重要的角色。Luo等[3]研究顯示，OmpA不僅可以促進(jìn)AB黏附于假絲酵母和人類肺上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)，同時(shí)也有助于AB侵入假絲酵母和肺上皮細(xì)胞體內(nèi)，誘導(dǎo)其凋亡。研究者利用PCR技術(shù)測定了臨床分離AB毒力因子OmpA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)臨床菌株對A549細(xì)胞的黏附率與OmpA呈正相關(guān)關(guān)系[4]。這表明OmpA是AB重要的黏附相關(guān)因素。通過觀察AB對A549細(xì)胞的黏附，發(fā)現(xiàn)其入侵上皮細(xì)胞是通過一種類似拉鏈的機(jī)制，這是一種微絲管依賴的攝取系統(tǒng)[5]。構(gòu)建OmpA基因失活菌株，用該菌來感染A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)基因失活菌株對細(xì)胞的黏附和侵襲均顯著低于同源型野生菌株[6]。因此，可以推斷AB在黏附和侵襲上皮細(xì)胞的過程中，OmpA起重要作用。OmpA可以引起線粒體分解，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。當(dāng)AB野生菌株感染HEp-2細(xì)胞后可以觀察到細(xì)胞線粒體分解、細(xì)胞凋亡[7]，但OmpA基因失活菌株感染HEp-2細(xì)胞后，細(xì)胞并沒有凋亡。研究者制備了純化的OmpA重組蛋白，并用該蛋白作用HEp-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組蛋白定位于HEp-2細(xì)胞線粒體上，引發(fā)了大量的促凋亡因子如細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，激活了Caspase-3，進(jìn)一步激活了Caspase-9，致使宿主細(xì)胞DNA降解[8]。這些說明OmpA可以進(jìn)入宿主線粒體內(nèi)并且啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。

1.2 OmpA對機(jī)體的免疫反應(yīng) OmpA既可以上調(diào)宿主免疫分子的表達(dá)，也可以影響宿主的免疫反應(yīng)。為了分析OmpA對固有免疫反應(yīng)的影響，研究者利用人工重組OmpA作用于人源性HEp-2細(xì)胞，結(jié)果OmpA引起了一系列基因差異性表達(dá)，如提高了免疫反應(yīng)的信號傳導(dǎo)分子、Toll樣受體2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等的表達(dá)，但卻并不能提高炎性因子和趨化因子的表達(dá)水平[9]。另有研究者使用OmpA侵染人樹突狀細(xì)胞(DC)，發(fā)現(xiàn)可以明顯活化DC，促進(jìn)DC高表達(dá)細(xì)胞表面分子CD40、CD54、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，同時(shí)誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-12，增強(qiáng)DC的免疫反應(yīng)能力[10]。Kunz 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，OmpA刺激的DC可以激活CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)Th1極化相關(guān)細(xì)胞因子譜的表達(dá)。這些說明AB OmpA在刺激人類免疫系統(tǒng)反應(yīng)的過程中發(fā)揮了重要作用。補(bǔ)體系統(tǒng)是人類固有免疫系統(tǒng)抵抗細(xì)菌感染的主要成分，而菌血癥是AB引起的常見院內(nèi)感染性疾病。Podnos等[12]研究顯示，AB可以抵抗正常人血清補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的裂解作用。研究者通過基因突變技術(shù)構(gòu)建了OmpA基因失活菌株，用人正常血清孵育該基因失活菌株一段時(shí)間后，該菌株多數(shù)被清除，而同源型野生菌株卻生存良好。表明OmpA與菌體介導(dǎo)的抗補(bǔ)體作用有很大關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)可能是該蛋白直接參與抗補(bǔ)體作用或者是參與其他抗補(bǔ)體相關(guān)的機(jī)制，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?？傊?，OmpA是AB比較重要的逃逸補(bǔ)體殺傷的表面蛋白。

1.3 OmpA相關(guān)的疫苗研究 Luo等[13]研究發(fā)現(xiàn)，OmpA是一種比較保守的外膜蛋白，其菌種間氨基酸同源性≥89%，因此菌種間蛋白差異較小。與人類細(xì)胞表面蛋白對比發(fā)現(xiàn)兩者同源性較低，通過不同的動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)其免疫原性較好。此外通過蛋白質(zhì)組學(xué)、二維電泳和質(zhì)譜分析等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，OmpA是AB外膜中含量最高的表面蛋白，因此可以考慮將其作為研制疫苗的候選抗原。Luo等應(yīng)用純化的重組OmpA和佐劑氫氧化鋁通過靜脈注射免疫糖尿病小鼠，2 d后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的抗OmpA抗體。當(dāng)免疫后的小鼠感染多耐藥AB后其存活率明顯高于對照組小鼠，其不同組織細(xì)菌載量也明顯低于對照組。與此同時(shí)，研究者用抗OmpA抗體進(jìn)行體外抗體活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗OmpA抗體不是直接加強(qiáng)血清中補(bǔ)體介導(dǎo)的固有免疫來殺滅菌體，而是通過抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用來殺滅菌體。此外，另有研究者用純化的AB OmpA作為抗原刺激小鼠鼻內(nèi)黏膜，來誘導(dǎo)產(chǎn)生局部和全身黏膜抗體。經(jīng)過一段時(shí)間刺激后，經(jīng)OmpA免疫過的小鼠感染臨床多重耐藥AB后，其生存率明顯高于同期對照組。這表明OmpA具有很好的免疫原性，可以經(jīng)局部誘導(dǎo)進(jìn)而產(chǎn)生全身獲得性體液免疫。研究者檢測了感染者和健康者血清，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)抗OmpA抗體為IgG抗體，且效價(jià)較高[14]。說明OmpA不僅具有很好的免疫原性，而且可以通過不同的途徑誘導(dǎo)機(jī)體免疫。

2 外膜蛋白33-36(Omp33-36)

ABOmp33-36是一種典型的革蘭陰性菌外膜孔蛋白，它與碳青霉烯類抗生素的耐藥有關(guān)，在菌體中充當(dāng)一種水通道蛋白[15]。Omp33-36可以隨外膜囊泡一起被分泌到菌體外，作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮其致病效應(yīng)。Rumbo等[15]研究顯示，Omp33-36可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究者用純化的Omp33-36作用于HEp-2細(xì)胞，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)HEp-2細(xì)胞皺縮、胞膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮。研究者構(gòu)建了Omp33-36基因失活的菌株感染吞噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)基因失活菌株介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯低于同源型野生菌。此外在小鼠全身感染的模型中同樣發(fā)現(xiàn)，基因失活組小鼠病死率明顯低于同源型野生菌株。這表明Omp33-36是AB非常重要的一個(gè)毒力因子，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是其致病的主要機(jī)制。Omp33-36可以隨外膜囊泡分泌至菌體外，因此可以考慮將其作為一個(gè)靶點(diǎn)，研究相應(yīng)的特異性抗體或相應(yīng)的藥物阻止其與宿主細(xì)胞的作用，為抗感染治療帶來新的希望。

3 外膜蛋白W(OmpW)

OmpW是一個(gè)由183個(gè)氨基酸構(gòu)成的疏水性孔蛋白，在已報(bào)道的AB中其同源性超過91%，且與銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的OmpW也具有很好的同源性[16]。OmpW不僅鑲嵌于外膜，也存在于細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)菌多種功能有關(guān)。通過構(gòu)建重組OmpW可以發(fā)現(xiàn)其形成了小分子通道，該通道與鐵離子的攝取有關(guān)，且屬于鐵調(diào)節(jié)子。當(dāng)AB生長在鐵離子豐富的環(huán)境中，鐵載體不能表達(dá)，OmpW可以高表達(dá)并促進(jìn)鐵的攝取[17]。這表明，OmpW是維持鐵離子在菌體內(nèi)平衡的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制。既往研究表明，OmpW可以潛在地引起AB對替加環(huán)素和亞胺培南的耐藥性。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，OmpW可以轉(zhuǎn)運(yùn)替加環(huán)素分子到外膜蛋白，但當(dāng)OmpW缺失后并不能影響AB對替加環(huán)素和亞胺培南的敏感性。這說明OmpW可能參與了對替加環(huán)素和亞胺培南的耐藥機(jī)制，但并不是決定性成分。

4 外膜蛋白22(Omp22)

Omp22由217個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有一個(gè)甘氨酸拉鏈和一個(gè)與OmpA蛋白C-端相似的肽段，且該肽段可以與肽聚糖結(jié)合。研究者用人肺上皮細(xì)胞A549和腫瘤細(xì)胞293FT檢測Omp22的毒性，發(fā)現(xiàn)該蛋白并不黏附和侵襲宿主細(xì)胞，只在高濃度情況下抑制細(xì)胞的生長[18]。表明Omp22并不是細(xì)菌的毒力因子。Omp22經(jīng)過折疊后具有免疫抗原表位，而且與人類蛋白質(zhì)同源性極低，可以考慮將其作為疫苗候選抗原。研究者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)重組Omp22主動(dòng)免疫的小鼠可以產(chǎn)生特異性高滴度的IgG抗體。隨后經(jīng)主動(dòng)和被動(dòng)免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)免疫后的小鼠其生存率增加、器官和外周血載菌量降低，血清中炎性細(xì)胞因子和趨化因子受到了抑制。這些研究表明，Omp22蛋白是一種新型值得開發(fā)的有效疫苗，可以通過其抗血清來控制AB的感染。

5 外膜蛋白AIS-1969(OmpAIS-1969)

AIS-1969是一種外膜蛋白，目前對其具體功能尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，其與BamA蛋白具有高度相似的三維結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析表明，AIS-1969基因序列在AB中高度保守，因此研究者考慮將其作為疫苗研究的靶點(diǎn)[19]。研究者用純化的可溶性AIS-1969α重組蛋白通過腹腔攻毒感染途徑構(gòu)建了動(dòng)物主動(dòng)和被動(dòng)免疫模型，發(fā)現(xiàn)AIS-1969α免疫機(jī)體后可激發(fā)高效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體對AB的清除，抑制炎癥因子的表達(dá)，抑制AB感染所引起的病理損傷。這說明OmpAIS-1969具有很好的抗原性，可以考慮作為疫苗研發(fā)的靶點(diǎn)，但對于其具體功能需要做深入的研究。

目前AB耐藥率嚴(yán)重，已經(jīng)對臨床大部分藥物耐藥，因此研制新的治療手段迫在眉睫?？垢腥局委熓飞?，很多微生物通過疫苗免疫促使人類免于病患。AB外膜蛋白眾多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，因此，研究這些外膜蛋白將會有利于人類找到合適的靶點(diǎn)構(gòu)建疫苗，為人類的抗感染治療增加新的手段。

[1] Nwugo CC, Arivett BA, Zimbler DL, et al. Effect of ethanol on differential protein production and expression of potential virulence functions in the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii[J]. PLoS One, 2012,7(12):e51936.

[2] Lopes BS, Hamouda A, Findlay J, et al. Effect of frameshift mutagen acriflavine on control of resistance genes in Acinetobacter baumannii[J]. J Med Microbiol, 2011,60(Pt 2):211-215.

[3] Luo LM, Wu LJ, Xiao YL, et al. Enhancing pili assembly and biofilm formation in Acinetobacter baumannii ATCC19606 using non-native acyl-homoserine lactones[J]. BMC Microbiol, 2015,15:62.

[4] Sato Y, Unno Y, Kawakami S, et al. Virulence characteristics of Acinetobacter baumannii clinical isolates vary with the expression levels of omps[J]. J Med Microbiol, 2017,66(2):203-212.

[5] Michalopoulos A, Falagas ME, Karatza DC, et al. Epidemiologic, clinical characteristics, and risk factors for adverse outcome in multiresistant gram-negative primary bacteremia of critically ill patients[J]. Am J Infect Control, 2011,39(5):396-400.

[6] Shields RK, Clancy CJ, Gillis LM, et al. Epidemiology, clinical characteristics and outcomes of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii infections among solid organ transplant recipients[J]. PLoS One, 2012,7(12):e52349.

[7] Wroblewska MM, Towner KJ, Marchel H, et al. Emergence and spread of carbapenem-resistant strains of Acinetobacter baumannii in a tertiary-care hospital in Poland[J]. Clin Microbiol Infect, 2007,13(5):490-496.

[8] Stephens C, Francis SJ, Abell V, et al. Emergence of resistant Acinetobacter baumannii in critically ill patients within an acute care teaching hospital and a long-term acute care hospital[J]. Am J Infect Control, 2007,35(4):212-215.

[9] Dy ME, Nord JA, LaBombardi VJ, et al. The emergence of resistant strains of Acinetobacter baumannii: clinical and infection control implications[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 1999,20(8):565-567.

[10] Eveillard M, Joly-Guillou ML. Emerging Acinetobacter baumannii infections and factors favouring their occurrence[J]. Pathol Biol (Paris), 2012,60(5):314-319.

[11] Kunz AN, Brook I. Emerging resistant Gram-negative aerobic bacilli in hospital-acquired infections[J]. Chemotherapy, 2010,56(6):492-500.

[12] Podnos YD, Cinat ME, Wilson SE, et al. Eradication of multi-drug resistant Acinetobacter from an intensive care unit[J]. Surg Infect (Larchmt), 2001,2(4):297-301.

[13] Luo G, Lin L, Ibrahim AS, et al. Active and passive immunization protects against lethal, extreme drug resistant-Acinetobacter baumannii infection[J]. PLoS One, 2012,7(1):e29446.

[14] Zhang X, Yang T, Cao J, et al. Mucosal immunization with purified OmpA elicited protective immunity against infections caused by multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Microb Pathog, 2016,96:20-25.

[15] Rumbo C, Tomas M, Fernandez Moreira E, et al. The Acinetobacter baumannii Omp33-36 porin is a virulence factor that induces apoptosis and modulates autophagy in human cells[J]. Infect Immun, 2014,82(11):4666-4680.

[16] Huang W, Wang S, Yao Y, et al. OmpW is a potential target for eliciting protective immunity against Acinetobacter baumannii infections[J]. Vaccine, 2015,33(36):4479-4485.

[17] Catel-Ferreira M, Marti S, Guillon L, et al. The outer membrane porin OmpW of Acinetobacter baumannii is involved in iron uptake and colistin binding[J]. FEBS Lett, 2016,590(2):224-231.

[18] Huang W, Yao Y, Wang S, et al. Immunization with a 22-kDa outer membrane protein elicits protective immunity to multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Sci Rep, 2016,6:20724.

[19] 蔡昌芝,馮強(qiáng),楊赟,等.AB外膜蛋白A1S_1969的克隆表達(dá)及免疫保護(hù)機(jī)制初步研究[J].免疫學(xué)雜志,2016,32(2):104-108.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.037

RQ939.11

A

1002-266X(2017)29-0110-03

2017-02-09)