徐秀梅，王蓓，翟虹，王彪，趙獻萍

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院,烏魯木齊830000 )

IL-1、ICAM-1在超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中的變化及其影響因素

徐秀梅，王蓓，翟虹，王彪，趙獻萍

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院,烏魯木齊830000 )

目的 探討超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中IL-1、ICAM-1水平的變化及其與超聲照射劑量的關系。方法 SD大鼠25只，隨機分為對照組5只，實驗組20只，實驗組根據(jù)超聲機械指數(shù)和照射時間隨機分為4個亞組：MI1.5照射5 min組(A1組)、MI1.5照射10 min組(A2組)、MI1.9照射5 min組(B1組)、MI1.9照射10 min組(B2組)，各5只。對照組注射造影劑Sonovue;實驗組在對照組基礎上使用超聲照射大鼠腦部顳窗，伊文思藍作為追蹤劑，使用光鏡觀察各組腦組織形態(tài)學變化，免疫組化法檢測IL-1、細胞間黏附分子1(ICAM-1)在腦組織中的表達。結(jié)果 實驗組肉眼觀察可見藍色染色，光鏡下可見細胞水腫、紅細胞滲出、個別細胞壞死。實驗組腦損傷組織IL-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)高于對照組(P均<0.05)，實驗組間比較，B1、B2組較A1、A2組損傷腦組織IL-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)增多(P均<0.05)。結(jié)論 超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中IL-1、ICAM-1表達升高，其水平與超聲照射劑量有關。

腦損傷；超聲；造影劑；血腦屏障；白細胞介素1；細胞間黏附分子1；大鼠

超聲聯(lián)合造影劑能夠成功開放血腦屏障[1]。文獻和本研究前期實驗證明，超聲聯(lián)合造影劑在開放血腦屏障時可引起一定程度的腦損傷[2]，但這種腦組織損傷的病理學基礎不明。文獻研究顯示，腦組織創(chuàng)傷后，炎癥反應是腦損傷病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)。腦損傷后炎性細胞成分的積聚，均會誘發(fā)炎癥前細胞因子、化學因子以及內(nèi)皮細胞、白細胞黏附因子的表達上調(diào)。2014年1月～2016年3月，本研究通過高強度超聲聯(lián)合造影劑開放大鼠血腦屏障的同時，觀察IL-1、細胞間黏附分子1(ICAM-1)在損傷腦組織中的表達變化，并探討其影響因素，為將來超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障預防腦組織損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康SD大鼠25只(新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量(200±50)g。伊文思藍溶液(百靈威科技有限公司生產(chǎn))；Sonovue造影劑(注射用六氟化硫微泡，BRACCO 公司生產(chǎn))；IL-1試劑盒、ICAM-1試劑盒(武漢博士德公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(使用美國西門子醫(yī)療設備公司的Sequoia-512型)，S15-8探頭，頻率12 MHz，MI設為1.9，采用連續(xù)成像方式，成像深度4 cm，TGC除進場完全抑制外，中遠場居中，聚焦于遠場。

1.2 分組及處理 將大鼠隨機分為對照組5只，實驗組20只，實驗組根據(jù)超聲機械指數(shù)和照射時間隨機分為4個亞組：MI1.5照射5 min組(A1組)、MI1.5照射10 min組(A2組)、MI1.9照射5 min組(B1組)、MI 1.9照射10 min組(B2組)，每小組5只。大鼠以3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg尾靜脈注射進行麻醉，動物麻醉后左側(cè)臥位固定于實驗臺上，剪除右眼與右耳連線至顱頂?shù)捏w毛作為超聲照射聲窗。對照組注射造影劑0.2 mL，并注射生理鹽水1 mL，不用超聲照射。實驗組分別根據(jù)超聲機械指數(shù)和照射時間注射造影劑0.2 mL，并注射生理鹽水1 mL，使用超聲波照射兔腦部顳窗。各組均隨后加0.5%的伊文思藍溶液(3 mL/kg)。實驗后頸動脈插管灌注，斷頭取腦取材。所取腦組織分別用4%的多聚甲醛固定，進行常規(guī)HE染色切片、免疫組化檢查。

1.3 觀察指標 血腦屏障開放情況：肉眼觀察腦組織伊文思藍染色情況(伊文思藍在活體動物中可以與循環(huán)蛋白結(jié)合而形成伊文思藍蛋白復合物而著色，但是完整的內(nèi)皮可以阻止這種結(jié)合的發(fā)生，因此可以用是否染色來判斷血腦屏障開放情況[3])。腦組織損傷情況：取腦組織冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察腦組織有無組織出血、壞死等表現(xiàn)。

1.4 腦損傷組織IL-1、ICAM-1蛋白的表達 采用免疫組化法。取腦損傷組織常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育 5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡 5 min×2次。5%～10% 正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加IL-1、ICAM-1一抗工作液，37 ℃ 孵育1～2 h或 4 ℃過夜。PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量生物素標記二抗工作液，37 ℃孵育10～30 min。PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育10～30 min。PBS沖洗，5 min ×3次。顯色劑顯色3～15 min(DAB或NBT/BCIP)。自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。免疫組化結(jié)果以染色為棕黃色為陽性表達，根據(jù)陽性細胞的分布情況，每張切片拍攝5個陽性視野，每例標本的切片隨機選取5個400倍視野，計算陽性細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血腦屏障開放情況 對照組肉眼觀未見藍色染色，實驗各組肉眼觀察可見藍色染色 。

2.2 腦組織形態(tài)學變化 對照組光鏡下未見腦組織水腫和形態(tài)學變化。實驗組肉眼觀察可見藍色染色，光鏡下可見細胞水腫，紅細胞滲出，個別細胞壞死。

2.3 各組腦損傷組織IL-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)比較 光鏡下見IL-1、ICAM-1的陽性表達產(chǎn)物呈棕色，對照組IL-1、ICAM-1不表達。實驗組IL-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)增多，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；實驗組間比較，B1、B2組較A1、A2組IL-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)增加(P均<0.05)，A1、A2組及B1、B2組之間比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組腦損傷組織ICAM-1、IL-1陽性細胞數(shù)比較(個/400倍視野，

注：與對照組比較，*P<0.05，與B1、B2組比較，★P<0.05。

3 討論

本課題組前期研究表明，超聲聯(lián)合造影劑能夠有效開放血腦屏障，但可造成一定程度的腦組織損傷。本研究結(jié)果顯示，照射區(qū)大鼠腦組織出現(xiàn)水腫，紅細胞滲出，并有少量細胞出現(xiàn)壞死。超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障的機制，大多數(shù)學者認為是超聲波與造影劑之間相互作用的結(jié)果，其中主要生物學效應是空化效應、熱效應及機械效應[4]。這幾種效應均可引起組織內(nèi)摩擦，使蛋白質(zhì)變性、細胞和組織變形，破壞靶區(qū)的細胞及其支持結(jié)構(gòu)，改變細胞功能，在形態(tài)學上主要表現(xiàn)為血管壁損傷、紅細胞漏出、腦組織水腫等特征[5]。

腦組織損傷形態(tài)學的改變均與炎癥反應有密切關系。以往大量文獻研究顯示，腦組織創(chuàng)傷后，炎癥反應是腦損傷病理生理過程中的重要組成環(huán)節(jié)。腦損傷后炎性細胞成分的積聚，均會誘發(fā)炎癥前細胞因子、化學因子以及內(nèi)皮細胞、白細胞黏附因子的表達上調(diào)[6～8]。本研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障時，與對照組比較，實驗組腦損傷組織中IL-1、ICAM-1表達量增加，說明IL-1、ICAM-1參與了腦組織損傷。

IL-1是體內(nèi)最重要的促炎細胞因子[9]。在炎癥反應和免疫反應中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。實驗證明，腦損傷可導致IL-1合成增加。在微血管受到損傷時，參與炎癥反應的黏附分子及其信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥反應和炎癥蔓延中發(fā)揮著重要作用[10]。ICAM-1是血細胞和血管內(nèi)皮細胞膜受損后釋放的一系列糖蛋白分子，在炎性反應、免疫應答、凝血與血小板形成以及維持正常內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)方面有重要作用，其在創(chuàng)傷性腦損傷后的病理生理過程中也起著重要作用。腦損傷后ICAM-1表達，在促進炎性細胞黏附并穿越血腦屏障時，將可能對血腦屏障細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變起調(diào)節(jié)甚至破壞作用，從而引起血腦屏障通透性增加，導致腦水腫形成[11，12]。

本研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障時，隨著超聲強度的增加，IL-1、ICAM-1陽性表達量增加，而隨著照射時間的增加，IL-1、ICAM-1陽性表達量增加不明顯，說明隨著超聲強度的加大，腦組織損傷程度加大，炎癥程度加重，超聲強度是影響腦組織損傷的一個重要因素，而超聲照射時間的長短對腦組織損傷程度影響不大，分析其原因可能是超聲造影劑的代謝時間所致，一般情況下，超聲造影劑的有效排出機體時間大約為5 min,在機體注射造影劑后，造影劑的濃度明顯下降，超聲照射對腦組織的影響明顯降低[13]。

綜上所述，超聲聯(lián)合造影劑開放大鼠血腦屏障能夠造成腦組織損傷，且腦組織損傷與炎癥因子表達密切相關，證實了高頻超聲聯(lián)合造影劑開放動物血腦屏障造成腦組織損傷的病理學基礎可能是炎癥反應。為將來臨床應用超聲波聯(lián)合微泡造影劑開放人血腦屏障進行藥物的傳遞和治療及對腦組織損傷的預防提供一定的理論基礎。

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翟虹(E-mail: zhaishuanghai@sina.com)

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2017-05-22)