韓露，崔凱，王振丹，李勝

(1濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250022；2山東大學附屬山東省腫瘤醫(yī)院 山東省醫(yī)學科學院)

·綜述·

食管鱗癌循環(huán)腫瘤細胞檢測方法研究進展

韓露1,2，崔凱2，王振丹2，李勝1,2

(1濟南大學 山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250022；2山東大學附屬山東省腫瘤醫(yī)院 山東省醫(yī)學科學院)

食管鱗癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，60%～80%食管鱗癌患者在接受根治性手術后出現(xiàn)復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞播散入血并形成轉(zhuǎn)移灶被認為是導致食管鱗癌患者預后較差的重要原因之一。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作導致腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在食管鱗癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。目前,已報道的CTCs檢測技術有50余種，各種方法優(yōu)缺點各不相同，其臨床適用情況也不盡相同。本文主要就食管鱗癌CTCs檢測方法的研究進展作一綜述。

食管鱗癌；循環(huán)腫瘤細胞；檢測技術；預后

食管鱗癌早期癥狀隱匿，惡性程度高，患者就診時多屬中晚期，故患者預后較差，5年生存率為15%～25%[1～3]，復發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者預后較差的主要原因。臨床上有相當一部分患者，就診時腫瘤分期較低，治療前也無明顯轉(zhuǎn)移證據(jù)，在行腫瘤根治術后卻早期死于腫瘤復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，說明存在用常規(guī)臨床檢驗和組織病理學方法不能檢出的癌細胞播散或隱性轉(zhuǎn)移[4]。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作導致腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞[5]。近年來隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，CTCs檢測日益引起臨床重視。CTCs檢測主要包括富集和鑒定兩個步驟。CTCs富集技術主要有基于細胞形態(tài)的密度梯度離心法、膜過濾分離法(ISET法)和免疫磁性富集方法(如Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)、免疫磁珠負性篩選策略等)[6～8]；鑒定技術包括免疫學技術、RT-PCR技術、酶聯(lián)免疫斑點技術和CTCs芯片技術等[9～11]；檢測方法眾多，但各具特征[12]。本文結(jié)合文獻就食管鱗癌CTCs的檢測方法研究進展作一綜述。

1 CTCs 的特點、分類及作用

CTCs是指存在于外周血中各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱。腫瘤組織每天會釋放大量腫瘤細胞入血，但這些腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中的存活率極低，一般每1×108個正常血細胞中僅含有1個[13]；Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌CTCs的上皮和間葉成分呈現(xiàn)動態(tài)改變，并根據(jù)上皮(E)和間質(zhì)(M)組織標志物的比例將CTCs分為E、E>M、E=M、E

2 食管鱗癌CTCs的主要檢測方法及其臨床評價

2.1 檢測方法 目前，食管鱗癌CTCs的檢測方法、研究數(shù)據(jù)遠遠落后于其他類型惡性腫瘤。其主要檢測方法有RT-PCR技術、免疫磁珠負性篩策略、Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)和ISET法4種。

2.1.1 RT-PCR技術 RT-PCR技術是將腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR擴增來識別腫瘤特異性mRNA的表達。這些特異性mRNA通常在正常外周血中不表達，因原發(fā)灶腫瘤細胞分泌的mRNA進入血液后被降解，但據(jù)此可推測檢測到的mRNA來自CTCs的表達。Cao等[18]以Survivin mRNA為檢測標志物，用RT-PCR技術檢測外周血中CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA的檢出率為47.2%，Survivin mRNA表達與腫瘤浸潤、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等明顯相關；隨訪發(fā)現(xiàn)，Survivin mRNA陽性者比陰性者復發(fā)率更高，生存期更短。表明RT-PCR技術檢測外周血CTCs的效能較好。RT-PCR技術能從(1～10)×106個正常細胞中檢測出1個腫瘤細胞，敏感性較高，是檢測腫瘤隱匿性微轉(zhuǎn)移的有效方法。但目前食管鱗癌CTCs檢測尚缺少統(tǒng)一的檢測標志物。此外，該方法需要破壞腫瘤細胞，無法對CTCs進行計數(shù)、形態(tài)學觀察及下游分析，限制了其在CTCs檢測中的應用。

2.1.2 免疫磁珠負性篩選策略 免疫磁珠是由John Ugelstar等于1979年首先制備出，該方法首先用紅細胞裂解液去除紅細胞，將標記抗CD45的Miltineyi納米磁珠與白細胞結(jié)合，通過強磁場時去除白細胞，富集到外周血稀有細胞；然后用免疫熒光方法檢測出抗上皮標志CK8/18/19陽性、抗白細胞標志CD45陰性和細胞核DAPI染色陽性的細胞，然后結(jié)合細胞大小、細胞核大小和形態(tài)等鑒定出CTCs[19]。任傳利等[20]將免疫磁珠負性篩選策略與原位雜交技術結(jié)合，檢測了11例食管鱗癌患者外周血CTCs，并對CTCs的8/20號染色體進行熒光原位雜交分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTCs的檢出率為43.8%，其中80%的CTCs伴有8/20號染色體非整倍體的改變；該研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中可見許多胞膜不完整或完全缺失、但直徑>15 μm的裸核，這些裸核都具有8/20號染色體的非整倍體改變。說明該技術不但能鑒定具有完整細胞結(jié)構的CTCs，還可鑒定胞質(zhì)、胞膜不完整或裸核樣CTCs的惡性表型。相比于RT-PCR技術，免疫磁珠負性篩選策略的優(yōu)點是可保證被分離靶細胞的形態(tài)和功能完整。其缺點是磁珠的包被效率受抗原包被質(zhì)量濃度的影響，而該濃度的確定目前尚缺乏統(tǒng)一標準。

2.1.3 Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng) Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)是美國強生公司旗下的Veridex公司開發(fā)的，用于腫瘤外周血循環(huán)上皮細胞的檢測儀，目前已通過FDA認證，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的檢測[21～23]。其通過抗原抗體反應捕獲表達EpCAM的細胞，從而實現(xiàn)對CTCs的富集，將富集的細胞固定后，通過熒光標記細胞角蛋白CK8、CK18和CK19抗體，抗原提呈細胞(APC)標記CD45抗體，用4，6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)進行細胞核染色后，使用自動熒光顯微鏡進行計數(shù)。該系統(tǒng)將CK+、CD45-和DAPI+的細胞定義為CTCs[24]。

目前關于Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)檢測食管鱗癌CTCs的研究較少，檢出率偏低，其原因可能是部分CTCs因發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而被漏檢。因此，該系統(tǒng)是否適用于食管鱗癌CTCs的檢測尚存在爭議。Matsushita等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)的檢出率為27.8%，對部分患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)，治療后部分反應、疾病穩(wěn)定和疾病進展患者分別占45.1%、16.9%和38%，治療后CTCs陽性者在疾病進展中的占比例明顯高于在部分反應中的比例。CTCs表達水平與患者遠處轉(zhuǎn)移明顯相關，治療過程中CTCs表達由陽性變?yōu)殛幮哉?，其預后和治療前CTCs陰性者的預后均較好。表明該系統(tǒng)檢測的CTCs結(jié)果能有效評估腫瘤患者的預后和放化療療效。Hiraiwa等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)對轉(zhuǎn)移性食管癌CTCs的檢出率為13%，患者外周血中CTCs陽性率與胸、腹膜轉(zhuǎn)移明顯相關，將CTCs的cut off值提高到3、4、5或10，二者仍具有明顯相關性。表明晚期食管鱗癌患者CTCs的檢測能預測腫瘤的胸、腹膜轉(zhuǎn)移。但Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)在食管鱗癌CTCs的檢出率僅為1.6%，故建議臨床上不使用Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)檢測食管鱗癌患者CTCs，其檢出率較低的原因有待進一步研究。

Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，被認為是CTCs檢測技術的金標準；但該系統(tǒng)無法檢出低表達或不表達上皮細胞黏附分子、非上皮表型及發(fā)生EMT的CTCs。

2.1.4 ISET技術 ISET技術是一種新型腫瘤細胞富集技術，由Vona等[28]在2000年開創(chuàng)并最先使用于腫瘤研究領域。ISET技術不依賴腫瘤相關標志物檢測CTCs，其檢測原理是根據(jù)腫瘤細胞直徑一般大于血細胞的特點，應用納米技術制作的聚碳酸酯濾過膜，對患者外周血進行濾過，腫瘤細胞因直徑大于濾孔而被吸附在濾膜上；然后對腫瘤細胞進行染色，并置于光鏡下觀察，最后根據(jù)CTCs的判定標準鑒別出CTCs。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，ISET技術對食管鱗癌CTCs的檢出率為32.8%，該研究首次在患者外周血中檢測到循環(huán)腫瘤微栓(CTM)，通過免疫熒光技術在CTM中檢測到EMT標志物Vimentin的表達，并發(fā)現(xiàn)其CTCs檢測結(jié)果與腫瘤病理分期和患者治療前血小板計數(shù)密切相關。因此認為，ISET技術檢測的CTCs結(jié)果可作為食管鱗癌臨床分期的有益補充，并提示食管鱗癌血行轉(zhuǎn)移與血小板增多關系密切。Bobek等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ISET技術對食管鱗癌CTCs的檢出率為62.8%，該研究成功分離和培養(yǎng)了食管鱗癌患者的CTCs，為進一步分析CTCs的形態(tài)學特征提供條件。ISET技術的優(yōu)點是操作簡便，價格低廉，分離后CTCs仍保留活力；缺點是缺乏特異性，一部分直徑更小的腫瘤細胞存在被漏檢的可能。

2.2 臨床評價 目前認為，食管鱗癌CTCs可能具有以下兩個特點：①部分CTCs發(fā)生了EMT；②CTCs及裸核發(fā)生了8/20號染色體的非整倍體改變。在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的CTCs研究中也存在部分CTCs因發(fā)生了EMT而被Celltracks?AutoPrep?系統(tǒng)漏檢的問題，因此該系統(tǒng)并不適于食管鱗癌CTCs的檢測。RT-PCR技術破壞了細胞，無法對CTCs的染色體進行分析，也不適用于食管鱗癌CTCs的檢測；免疫磁珠負性篩選策略和ISET技術能滿足食管鱗癌CTCs的檢測，后者比前者操作更簡便，檢測費用更低，并且分離后CTCs仍可保留活力。綜合考慮，ISET技術最適用于食管鱗癌CTCs的檢測。

目前普遍認為，食管鱗癌CTCs檢測在食管鱗癌的早期診斷、治療和預后評估等方面具有重要的臨床意義，尤其是能對治療效果和患者預后進行實時監(jiān)控，可使患者獲益最大化。相對于乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤，目前關于食管鱗癌CTCs的研究較少；受制于樣本量的限制，該領域尚缺少權威的研究結(jié)論。

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國家重點研發(fā)計劃項目(SQ2016ZY04003762)。

李勝(E-mail： drlisheng@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.033

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2016-08-15)