李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014)

糖尿病大鼠表皮組織表皮干細胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表達變化

李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014)

目的觀察糖尿病(DM)大鼠表皮組織表皮干細胞(ESCs)中β-連環(huán)素(β-catenin)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細胞角蛋白K6表達變化，探討DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制。方法將30只大鼠隨機分為觀察組和對照組，各15例。觀察組用鏈脲佐菌素法制作DM模型，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。造模成功28 d后取兩組大鼠表皮組織，分離ESCs，采用免疫組化SP法測算兩組ESCs的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率和β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色積分光密度值(IA)。結果觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA相比P均<0.05。結論DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達降低，這可能是DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制。

糖尿??；表皮干細胞；β-連環(huán)素；周期蛋白D1；Wnt通路蛋白1；細胞角蛋白；動物實驗

糖尿病(DM)患者的皮膚創(chuàng)傷面具有難愈合或不愈合的特點，治療棘手[1]。表皮干細胞(ESCs)具有生成新皮膚及附屬組織、修復創(chuàng)傷口、促進表皮良性異化的功能，是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的重要細胞[2，3]。DM患者表皮組織中ESCs結構發(fā)生變化，導致其功能降低，但其機制并不明確[4]。β-catenin是一種調節(jié)表皮ESCs分化的重要細胞因子，周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細胞角蛋白K6是其下游靶基因表達的蛋白[5]。DM大鼠表皮組織ESCs結構和功能的變化可能與β-catenin及其下游cyc1inD1、Wnt-1、K6表達變化有關。本研究觀察了DM大鼠ESCs中β-catenin、cyc1inD1、Wnt-1、K6表達變化，探討DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 30只實驗SD雄性大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司，體質量300～360 g，實驗前均于培養(yǎng)室內喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃，相對濕度50～60%。鏈脲佐菌素購自上海士鋒生物科技有限公司，β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1抗體試劑均購自美國圣克魯斯生物技術公司，K6抗體購自上海拜力生物科技有限公司，免疫組織化學SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司，免疫組織化學試劑盒、DAB試劑盒、PBS、檸檬酸鈉溶液均購自上海金標公司，K-SFM培養(yǎng)基、胎牛血清素購自英國Gibco公司，Ⅳ型膠原購自美國Sigma公司，免疫定量ELISA分析試劑盒購自美國R&D公司。BHC-1300IIA2超凈無菌工作臺購自蘇州蘇潔凈化設備公司，GTR16-2高速離心機購自北京時代北利離心機有限公司，DM1000顯微鏡購自德國徠卡公司，奧林巴斯CX31數(shù)碼圖像系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司，KD-202A石蠟切片機購自西安金馬醫(yī)療器械有限公司，穩(wěn)步血糖測定儀購自美國強生公司。

1.2 大鼠分組及DM模型建立方法 將30只大鼠隨機分為分為觀察組及對照組，每組15只。觀察組大鼠采用鏈脲佐菌素建立DM模型，具體方法如下[6]：大鼠腹部注射55～60 mg/kg鏈脲佐菌素溶液，正常喂食、喂水2 d后每日測血糖，連續(xù)3次血糖高于6.8 mmol/L且大鼠現(xiàn)飲食、飲水、排尿多但體型消瘦判定為造模成功。觀察組均造模成功，然后繼續(xù)飼養(yǎng)28 d。對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 表皮組織ESCs分離方法 在無菌環(huán)境下用手術刀切取兩組大鼠尾背部表皮，無菌碘液棉簽擦凈所取標本，生理鹽水沖洗10 min，放置在超凈工作臺上[9]，手術刀逐次清除多余結締及皮下組織；放入無菌培養(yǎng)皿，分別青霉素G溶液1次×3 min、D-Hank′s溶液2次×3 min漂洗。切表皮標本約為0.5 cm×0.5 cm碎塊，放入培養(yǎng)瓶內，加入5 mL的0.25～0.3%胰蛋白酶+EDTA溶液，放入4 ℃冰箱培養(yǎng)12 h。取出放入培養(yǎng)皿內，滴加約2 mL PBS，再次D-Hank′s 溶液2次漂洗3 min，后將標本表皮層剝離粉碎，放入無菌培養(yǎng)瓶內，再次D-Hank′s溶液吹打5～7次，標本混合篩網(wǎng)過濾，清液進入離心管，1 200 r/min離心5min。棄上清后作細胞懸液并計數(shù)細胞，將懸液滴入培養(yǎng)板于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養(yǎng)20 min，去培養(yǎng)液及未勃附細胞，滴入有ESCs培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養(yǎng)，換液1次/3 d，直到約70%～80%ESCs細胞1∶3融合傳代，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，滴0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液調細胞溶液為懸浮狀態(tài)，30 s內滴入10% 胎牛清血素，1 200 r/min離心5 min，去分離上層液，滴入K-SFM培養(yǎng)基，吹打、重懸后接種于培養(yǎng)瓶，去未貼壁細胞。

1.4 ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6檢測方法 采用免疫組化SP法。兩組ESCs培養(yǎng)24 h后，取細胞密度1×105/mL培養(yǎng)液滴入玻片，PBS浸3次，每次 3 min，90%乙醇固定20 min，PBS浸3次，每次3 min，加0.5% 曲拉通X-100孵育15min，PBS浸3 次× 3 min/次，滴40 mL 3%H2O2阻斷液，25 ℃條件下孵育10 min，PBS洗滌3 次× 3 min/次，滴50 μL一抗覆蓋切片，入37 ℃水浴箱育30 min，PBS洗3次×3 min/次，滴二抗，PBS洗3次，2 min/次，DAB顯色及蘇木素復染，乙醇脫水干燥切片。Ⅳ型樹膠封固。倒置相差顯微鏡下觀察(400×)，β-catenin陽性染色為細胞膜上棕黃色顆粒，cyclinD1陽性染色為細胞核棕黃色顆粒，K6和Wnt-1陽性染色為細胞質棕黃色顆粒。隨機選取3個視野，每個視野計數(shù)1 000個細胞，計算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率。對染色切片進行拍照，用奧林巴斯CX31數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色積分光密度值(IA)。

2 結果

觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA相比P均<0.05。

3 討論

目前全球DM患者人數(shù)接近2.8億，我國DM患者人數(shù)處于全球第二位[13，14]，并呈現(xiàn)不斷增多的態(tài)勢，形勢較為嚴峻。DM患者并發(fā)潰瘍、創(chuàng)傷后創(chuàng)面難以愈合，致殘率極高，給患者身體及心理帶來極大痛苦[15，16]。DM患者皮膚創(chuàng)傷難以愈合的原因較為復雜。國內外眾多研究顯示，DM造成創(chuàng)傷難愈合的主要原因為：①DM會引起患者體內糖代謝功能障礙，造成體內糖基化物質濃度上升，破壞細胞膜結構，造成表皮細胞凋亡[17]；②DM患者多伴發(fā)神經(jīng)性病變，導致機體促表皮愈合神經(jīng)信號傳導受阻，造成人體正常對損傷自修復調節(jié)機制運轉滯后，干擾正常的組織及皮膚自然性愈合[18]；③DM可致患者生長因子受體異變及濃度下降，阻礙表皮細胞及皮下組織、肌肉組織細胞DNA合成[19]，干擾正常構成新人體組織細胞的增殖，減慢新組織添補創(chuàng)傷口[20]；④多數(shù)DM患者因病變及營養(yǎng)物質攝入量不足，自身免疫功能下降，故對侵入細菌抵抗力不足，可致創(chuàng)傷口感染，促使傷口膿化，進一步干擾表皮細胞更新增殖；⑤DM患者血運能力下降，造成表皮創(chuàng)傷口血液流量降低，造成創(chuàng)傷壞死。針對這些原因，有研究提出在促DM患者創(chuàng)傷愈合過程中，利用人體自然促表皮細胞增殖因子使得創(chuàng)面上皮化功能正常發(fā)揮，提高愈合效果，同時已有研究證明[21]，DM大鼠表皮組織ESCs數(shù)量少、活性低。因此，我們認為ESCs結構變化導致的功能下降可能是導致DM患者創(chuàng)面難愈的一個重要因素。

有研究顯示[22]，β-catenin是一種調節(jié)表皮ESCs分化的重要因子，促進機體對創(chuàng)傷進行自然性修復，其通過和上表皮組織內ESCs內鈣黏蛋白結合[23]，促進細胞間黏合及和外基質鏈接，保證表皮結構完整性，激活Wnt通路[24]，而Wnt-1和表皮組織生成、生長及愈合具有密切關系[25]。同時，β-catenin還可激活其下游靶基因CyclinD1，提高其表達水平，其可加快表皮細胞生長周期進階速度，細胞增殖及分化關系較密切，加快表皮自修復進程。K6蛋白作為一種人體內促細胞增殖的角蛋白，其和細胞增殖關系較密切，有研究認為K6濃度水平與表皮細胞過度增殖具有顯著的正相關性。本研究結果顯示，觀察組DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6陽性表達率和陽性染色IA均低于對照組，說明DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達降低。筆者推測這可能是導致DM大鼠表皮組織ESCs功能下降的原因。

[1] 史佩娜,高夢娜. 皮膚創(chuàng)傷修復機制及治療方法研究進展[J]. 浙江醫(yī)學,2014,10(15):1349-1353.

[2] 蔡黔,萬江波,梁文佳. 轉染血管內皮生長因子基因的骨髓間充質干細胞修復糖尿病大鼠足背創(chuàng)面[J].中國組織工程研究,2014,50(37):5988-5992.

[3] Yu JY, Ho RJ. Ovatodiolide Targets β-catenin Signaling in Suppressing Tumorigenesis and Overcoming Drug Resistance in Renal Cell Carcinoma[J]. CAM, 2013,2013(16):1616-1628.

[4] Simoneau N , Coulombe M. SHP-1 inhibits β-catenin function by inducing its degradation and interfering with its association with TATA-binding protein[J]. Cell Signal, 2011,23(1):269-279.

[5] Emanuela A, Rossano G. Correction:mTrop1/Epcam knockout mice develop congenital tufting enteropathy through dysregulation of intestinal E-cadherin/β-catenin[J]. PLoS One, 2013,8(5):245-249.

[6] Zhu PF, Liu YY. Silencing of pancreatic adenocarcinoma upregulated factor by RNA interference inhibits the malignant phenotypes of human colorectal cancer cells[J]. Oncol Rep, 2013,30(1):213-220.

[7] Luciana H, Patrcia O. MAPKs and Signal Transduction in the control of gastrointestinal epithelial cell proliferation and differentiation[J]. Inter J Molecul Sci, 2013,14(5):10143-10161.

[8] Hyun CD, Yeo KJ. Recalcitrant cutaneous ulcer of comorbid patient treated with platelet rich plasma: a case report[J]. J Korean Med Sci, 2012,27(12):1604-1606.

[9] Ran L,Li C. Impact of topical application of autologous platelet-rich gel on medical expenditure and length of stay in hospitals in diabetic patients with refractory cutaneous ulcers[J]. J Sichuan Uni, 2012,43(5):762-765.

[10] Lu JH, Gong SL. Advances in the research of treating refractory diabetic wounds with stem cells[J]. Chin J Burn,2014,30(6):518-520.

[11] 弓家弘,陸樹良. 干細胞治療糖尿病難愈創(chuàng)面研究進展[J].中華燒傷雜志,2014,30(6):518-521.

[12] Min P,Songhie K. Effective healing of diabetic skin wounds by using nonviral gene therapy based on minicircle vascular endothelial growth factor DNA and a cationic dendrimer[J].J Gene Med, 2012,14(4):272-278.

[13] Chen GQ, Shan YN. Evaluation of the effects of homologous platelet gel on healing lower extremity wounds in patients with diabetes[J].Inter J Lower Extr Wound, 2013,12(1):22-29.

[14] Masaaki T, Hitoshi M. The usefulness and development of maggots therapy using medical aseptic flies larvae for refractory wound[J]. J Jap Biochem Society, 2014,86(5):620-625.

[15] Li LY, Xie ML. Improved refractory wound healing with administration of acidic fibroblast growth factor in diabetic rats[J]. Diabetes Res Clin Prac, 2011,93(3):396-403.

[16] Li FL, Li H. Effects of external application of Chinese medicine on diabetic ulcers and the expressions of β-catenin, c-myc and K6[J]. Chin J Integrat Med, 2011,17(4):261-266.

[17] Mario L,Ernesto L. Effects of a pulsatile electrostatic field on ischemic injury to the diabetic foot: evaluation of refractory ulcers[J]. Prim Care Diabetes, 2014,8(3):244-249.

[18] Zhang XJ, Ge YZ. Advances in research of the mechanism of covert disorder in diabetic skin][J]. Chin J Burn, 2012,28(1):51-53.

[19] 鄧潔,羅羽. 不同換藥方式對糖尿病模型小鼠和正常小鼠創(chuàng)面愈合影響的實驗研究[J]. 護理研究,2014,24(25):3093-3095.

[20] Chen L,Tie LY. GTP cyclohydrolase I prevents diabetic-impaired endothelial progenitor cells and wound healing by suppressing oxidative stress/thrombospondin-1[J]. Am J Physiol Endocrinol Metabol, 2014,306(10):1120-1131.

[21] Li L, Tie Y. Genistein accelerates refractory wound healing by suppressing superoxide and FoxO1/iNOS pathway in type 1 diabetes[J]. J Nutrit Biochem, 2013,24(1):88-96.

[22] 劉移峰,劉德伍. 糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面微小RNA差異表達譜分析[J]. 中華實驗外科雜志,2015,32(1):57-59.

[23] 崔勝勇,劉琰,章雄. 巨噬細胞功能障礙與糖尿病慢性難愈創(chuàng)面的關系[J].中華燒傷雜志,2014,30(3):264-269.

[24] 郭相凱,王彥. 糖尿病患者皮膚損傷生物治療的新進展[J].中華醫(yī)學美學美容雜志,2014,20(3):235-237.

[25] 弓家弘,陸樹良.干細胞治療糖尿病難愈創(chuàng)面研究進展[J].中華燒傷雜志,2014,30(6):518-521.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.011

R587.1

A

1002-266X(2017)35-0036-03

2016-12-20)