張 澤

（黑龍江省七臺河市北興農(nóng)場畜牧科，黑龍江七臺河 154625）

動物診斷血清制備的程序

張 澤

（黑龍江省七臺河市北興農(nóng)場畜牧科，黑龍江七臺河 154625）

制備診斷用血清的程序包括免疫動物的選擇、免疫原的制備、免疫方法和程序、血清的采集、血清的處理、血清的檢驗和血清的標(biāo)化等。制備診斷血清的動物多用家兔、豚鼠、馬、牛、羊及豬等?？乖闹苽洳糠纸榻B了細(xì)菌性抗原的制備和病毒性抗原的制備。免疫方法部分介紹了注射方法、抗體產(chǎn)生規(guī)律、解除免疫麻痹等內(nèi)容。制備診斷血清的免疫程序無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。最后一次高度免疫注射免疫抗原后8～10d可進(jìn)行第一次采血。本文最后介紹了血液的采集與血清的提取。

動物；診斷；血清；制備；程序

1 動物的選擇

制備診斷血清的動物多用家兔、豚鼠、馬、牛、羊及豬等。進(jìn)行免疫前，需經(jīng)健康檢查，確認(rèn)無傳染病，尤其是慢性傳染病，如結(jié)核、布氏桿菌病等，并健壯者方可使用。免疫用動物以青年、健壯、雄性，沒作過任何疫苗接種的動物為佳。

2 抗原的制備

普通診斷血清根據(jù)所含抗體種類的不同可分為許多種，如含有多型或多群抗體的血清稱為多價診斷血清；含有一種抗體的稱為單價診斷血清；僅含有鞭毛抗體的稱為H診斷血清；僅含有菌體抗體的稱為O診斷血清；含有針對菌毛和莢膜抗體的稱為K診斷血清；還有抗病毒診斷血清和抗毒素診斷血清。

在制備診斷血清的過程中，能否制得滿意合格的抗體取決于諸多因素，而合格的抗原則是制備高質(zhì)量抗體的決定因素。

（1）細(xì)菌性抗原的制備。在獲得細(xì)菌良好增殖的培養(yǎng)液后，為減少由培養(yǎng)基帶來的非特異性成分，可用離心沉淀法將其除去，將菌體洗滌2次制成一定濃度的菌體懸液；或?qū)⒓?xì)菌培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上，用生理鹽水沖洗菌落，制成一定濃度的菌體懸液。菌體懸液可直接用作高度免疫的抗原，或者經(jīng)過滅活后作為基礎(chǔ)免疫抗原。

（2）病毒性抗原的制備。病毒都含于組織細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)使病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。對以組織培養(yǎng)獲得的材料或病理組織材料，均須先將其磨碎，然后用反復(fù)凍融、超聲波裂解等方法使細(xì)胞破裂，將病毒釋放出來；繼之用差速離心、超濾等方法進(jìn)行純化。經(jīng)純化后的病毒液即可用來進(jìn)行高度免疫。制作抗病毒血清的基礎(chǔ)免疫一般多采用疫苗接種，高度免疫時用純化后的病毒液。

3 免疫方法

從被免疫動物初次接受免疫原刺激，到產(chǎn)生少量抗體，這一段時間稱為基礎(chǔ)免疫?；A(chǔ)免疫水平、免疫原的強(qiáng)度、注射次數(shù)及注射間隔時間、前后程序的問隔等；對以后加強(qiáng)免疫的成功與否、免疫應(yīng)答水平及動物的健康狀態(tài)均有影響，須根據(jù)具體條件制定出最佳免疫實施方案，并應(yīng)注意以下各個方面。

（1）注射方法。基礎(chǔ)免疫的抗原劑量較小以采用皮下、肌肉注射為好；加強(qiáng)免疫（高度免疫）抗原劑量大以靜脈注射為好。

（2）抗體產(chǎn)生規(guī)律。每一次注射抗原后，血清中的抗體水平都會發(fā)生短暫的下降，繼之快速升高，達(dá)到峰值后又緩慢下降。掌握這一規(guī)律，在最好時機(jī)進(jìn)行抗原注射或采血，對生產(chǎn)抗血清是有利的。機(jī)械的進(jìn)行抗原注射或采血是不科學(xué)的。

（3）有的動物在長期免疫和采血過程中，血清中的抗體水平上不去，對抗原的再刺激無應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生免疫麻痹。這與注射抗原的劑量、注射間隔時間等因素有關(guān)，對此應(yīng)讓免疫動物充分休息，并調(diào)整免疫程序，以解除免疫麻痹。

4 免疫程序

制備診斷血清的免疫程序無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般對于特異性要求高的診斷血清應(yīng)采用小劑量，無佐劑，短程免疫；如要求免疫血清效價高，則可采用大劑量，加佐劑，長程免疫。共需免疫14次，歷時2.5個月。在最后一次免疫后9～10d采血檢查，效價合格后采血，分離血清，加0.5%石炭酸或0.01%硫柳汞，靜置于2～15℃條件下45d左右，吸取上清液經(jīng)過濾除菌，即為炭疽沉淀素血清。

5 血液的采集與血清的提取

采血量可按動物的10ml/kg計算。采血動物前一天下午不喂給精料，只給飼草和飲水，夜間進(jìn)行禁食，第二天上午空腹時采血。動物禁食一夜，可避免血液中出現(xiàn)乳糜而獲得澄清的血清。3～4d后進(jìn)行第二次采血。如果要獲得較多的血清，于采血后3～5d再次注射大量抗原，如此循環(huán)進(jìn)行采血及注射抗原。采得的血液常用自然凝固加壓法提取血清，提取血清時根據(jù)所采血液的量，選擇不同大小的玻璃容器，洗滌干凈，滅菌后備用。采血的以滅菌生理鹽水濕潤一下玻璃容器內(nèi)壁，采血后置于室溫下，待完全凝固后，在血液凝塊上加以滅菌的不銹鋼壓砣，血清即可析出，并可獲得較好的分離效果。為了便于長期保存，提取的免疫血清常用鹽析法和胃酶消化進(jìn)行精制，或用低溫酒精沉淀、等電點沉淀、金屬離子沉淀、超速離心、離子交換、纖維素層析和凝膠過濾等方法精制提純，制成凍干劑長期保存。

6 診斷血清的檢驗與標(biāo)化

（1）診斷血清的檢驗。診斷血清的檢查包括物理性狀的檢查、特異性檢查和效價的檢查。不同的診斷血清有不同的檢查方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。診斷用血清的檢查主要有物理性狀的檢查、特異性檢查和效價的檢查；一般作為沉淀反應(yīng)用的陽性血清，其效價應(yīng)達(dá)到1：16～1：32以上才能應(yīng)用。

（2）診斷血清的標(biāo)化。診斷用陽性血清，特別是分群血清和分型血清等，均須標(biāo)化成為標(biāo)準(zhǔn)品或參考標(biāo)準(zhǔn)品，有些還需用國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)化，定出國際單位（IU），如破傷風(fēng)抗毒素的“AE”單位，沙門氏菌因子血清、梭菌類抗毒素分型血清的標(biāo)準(zhǔn)品等，均可以WHO指定的Weybridge國際標(biāo)準(zhǔn)實驗室引進(jìn)參考標(biāo)準(zhǔn)血清，標(biāo)化成國家級參考血清，這種標(biāo)準(zhǔn)品主要用來標(biāo)化內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，作為制品發(fā)放前的最終檢定。

[1] 曹曉真，任永麗，劉溪源.動物采血及血清制備注意事項[J].寧夏農(nóng)林科技，2016，57（8）：45.

張澤（1979—），男，黑龍江七臺河市勃利縣人，大專，助理獸醫(yī)師，主要從事動物臨床診斷及重大動物疫病預(yù)防工作。