王加良+丁祿榮+叢軍茲+尹昌浩

[摘要] 目的 研究黃芪和三七成分結(jié)合對腦缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信號通路和炎性因子的影響作用。 方法 該次研究地點為牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院藥劑科，2016年2—10月選取SP大鼠 45只分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組，每組15只，其中假手術(shù)組只進(jìn)行大腦中動脈的剝離不進(jìn)行栓塞。腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組 進(jìn)行 線栓法 阻塞 大腦中動脈2 h后 放開模擬腦缺血再灌注的條件。進(jìn)行各時間點缺血再灌注后3、6、24、72 h的各個指標(biāo)的變化。結(jié)果 腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)增加，分別為（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達(dá)（2.58±0.16），三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)，分別為（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)效果。腦缺血/再灌注后，胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達(dá)增加，NF-κB的核轉(zhuǎn)為率升高。 結(jié)論 黃芪和三七的主要成分配伍可以有效抑制缺血/再灌注后的腦組織NF-κB信號通路的激活，進(jìn)而減少炎性細(xì)胞因子的生成，進(jìn)而減輕腦缺血后腦組織繼發(fā)炎癥，更好的保護(hù)腦組織。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；三七；腦缺血/再灌注；小鼠NF-κB信號通路；炎性因子

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（c）-0028-04

Effect of Astragalus Membranaceus and Sanqi Component on the NF-κB Signal Channel and Inflammatory Factor of Cerebral Ischemia-reperfusion Mice

WANG Jia-liang1， DING Lu-rong1， CONG Jun-zi1， YIN Chang-hao2

1.Department of Pharmacy， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China；2.Department of neurology， Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective To research the effect of astragalus membranaceus and sanqi component on the NF-κB signal channel and inflammatory factor of cerebral ischemia-reperfusion mice. Methods 45 SP rats in department of pharmacy，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical Colkge from February to October 2016 were selected and divided into three groups with 15 cases in each， the Sham-operated group were given only brain arterial dissection but not embolism， and the cerebral ischemia-reperfusion group and the astragalin treatment for cerebral ischemia-reperfusion group released the condition of stimulating cerebral ischemia reperfusion after blocking the brain artery by the suture-occluded method， and the changes of various indexes at 3，6，24，72 h after the ischemia-reperfusion at each time point were observed. Results After the cerebral ischemia-reperfusion， the brain tissue TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA expression could increase， （3.58±0.19）， （1.06±0.18）， （2.39±0.27）， and Astragalus membranaceus could reduce the expression of TNF-αmRNA， （2.58±0.16） and Sanqi could reduce the expression of TNF-α，IL-β and ICAM-1mRNA （0.65±0.11） and （1.79±0.23）， and the combination of the two drugs could obviously inhibit the expression effect of inflammatory cytokines， after cerebral ischemia-reperfusion， the expression of kytoplasm NF-κB protein obviously decreased， and the expression of karyon NF-κB protein obviously increased and the examination and transmission rate of NF-κB increased. Conclusion The compatibility of astragalus membranaceus and sanqi can effectively inhibit the activation of brain tissue NF-κB signal channel after the cerebral ischemia-reperfusion thus reducing the production of inflammatory cytokines and relieving the brain tissue secondary inflammation after the cerebral ischemia and better protecting the brain tissues.

[Key words] Astragalus membranaceus； Sanqi； Cerebral ischemia-reperfusion； NF-κB signal channel of mice； Inflammatory factor

腦血管病在臨床上是常見及多發(fā)病，并且是當(dāng)前3大致死疾病中的一種，該病有著較高的發(fā)病率、病死率、致殘率，缺血性腦血管病患者的人數(shù)在近幾年出現(xiàn)了上升[1-2]。缺血性腦血管病特別是腦缺血后再灌注損傷，有著極大的危害。腦缺血再灌注損傷指的是腦缺血造成的腦細(xì)胞損傷，將血液再灌注恢復(fù)之后，缺血性損傷會出現(xiàn)加重的情況[3-4]。此次研究時間為2016年2—10月，主要內(nèi)容是研究黃芪和三七成分結(jié)合對腦缺血/再灌注小鼠Nα，NF-κB信號通路和炎性因子的影響作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SPF級的雄性C57BL/6小鼠45只，體質(zhì)量18～22 g，年齡6個月～1年，由湖南省維通利華實驗動物有限公司提供，合格證為：SCXK（湘）2009-0004。飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，濕度是45%，溫度是25℃。腦缺血再灌注的動物模型的制備：用頭端處理的尼龍釣絲，從頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入，可逆性阻斷大鼠一側(cè)大腦中動脈（MCA）。2 h后抽出釣線，制作成腦缺血再灌注的動物模型。將分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組，每組15只；兩組樣本的一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可以進(jìn)行比較。

1.2 方法

其中假手術(shù)組只進(jìn)行大腦中動脈的剝離不進(jìn)行栓塞。腦缺血再灌注組、黃芪多糖治療腦缺血再灌注組進(jìn)行線栓法阻塞大腦中動脈2 h后放開模擬腦缺血再灌注的條件。進(jìn)行各時間點缺血再灌注后各個指標(biāo)的變化。①缺血再灌注后各個時間點的病理變化，組織化學(xué)染色證實腦缺血模型是否成功（包括小血管內(nèi)皮的損傷，神經(jīng)元的損傷）。②電鏡下利用伊文思蘭 （evansblue，EB）的滲透性評估血腦屏障的通透性，透射電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化。③RT-PCR法檢測不同時間點 TLR4 、MyD88 mRNA水平的變化。④Westblot 法檢測不同時間點 TLR4 、MyD88 蛋白水平的變化。⑤ELISA法檢測IL-1、IL-6、TNF-a的量的變化。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理，先將各組的數(shù)據(jù)通過方差齊性檢驗，多組間對比采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)會增加

黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達(dá)，三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)效果。腦缺血/再灌注后，胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達(dá)增加，NF-κB的核轉(zhuǎn)為率升高。詳情見見表1。

2.2 各組腦組織的p-IkBα、胞核NF-kB蛋白表達(dá)、胞質(zhì)和NF-kB核轉(zhuǎn)位率對比

和假手術(shù)組比較，腦缺血灌注組的p-IkBα蛋白表達(dá)顯著增加。黃芪多糖治療組降低p-IkBα蛋白表達(dá)的效果要強于各組。見圖1。

3 結(jié)論

缺血再灌注屬于缺血后的一種比較特殊的狀態(tài)，能夠?qū)υ瓉淼娜毖該p傷進(jìn)行加重。它的產(chǎn)生機制當(dāng)前并不十分清楚。Cao等[5]得知TLR4-/-小鼠在出現(xiàn)腦缺血再灌注后，腦損害程度要比野生鼠輕，血清TNF-α含量出現(xiàn)了顯著降低。針對體外培養(yǎng)BV-2細(xì)胞模擬腦缺血再灌注，同樣得到近似度較高的結(jié)果，運用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（ RT-PCR）法對TLR4和核因子-κB（NF-κB） mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測后得知其出現(xiàn)了顯著增高，TNF-α水平同樣也出現(xiàn)了增高。以此可以可以推導(dǎo)得知TLR4參與了腦缺血再灌注后炎癥損傷的整個過程。Hua等利用鼠全腦缺血再灌注模型研究得知，野生鼠假手術(shù)組內(nèi)，腦組織內(nèi)不存在TLR4表達(dá)；而GCI/R后的72 h中，野生鼠海馬區(qū)及尾狀核保持在TLR4免疫活性；扣帶后回以及其它皮質(zhì)區(qū)、丘腦前核、內(nèi)囊、胼胝體等白質(zhì)也有免疫活性，只是其活性很低；此外還得知，野生鼠NF-κB活性及磷酸化κB抑制因子都出現(xiàn)了升高，降低的是TLR4-/-的炎癥酶原水平。上述內(nèi)容顯示，腦缺血再灌注后， TLR4信號通路得到激活，同時關(guān)系著抑制 （PI-3K） /Akt的信號通路，后者主要是抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵信號通路[6]。

黃芪的作用是補氣固表。其中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類、甙類、生物堿、氨基酸、微量元素等活性物質(zhì) ，多糖免疫活性最佳[7-8]。自20世紀(jì) 80年代以來 ，關(guān)于對黃芪多糖 （APS）的研究報道中得知 ：自黃芪根內(nèi)提取出的多糖APS是葡萄糖及阿拉伯糖多聚糖 ，毒性低 ，存在十分廣泛的的免疫增強及抗病毒功能，可以解除植物血凝素 （PHA）毒性用，能有效抑制抗免疫抑制藥物如強松龍 （PDS）、環(huán)磷酰胺 （Cy）等。黃芪多糖的免疫藥理學(xué)研究現(xiàn)狀主要涉及幾個方面：①調(diào)節(jié)肌體免疫功能：白介素-2（IL-2）可以提升巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）殺傷性；②直接調(diào)節(jié)對肌體存在重要免疫功能的T及B細(xì)胞分化增生。

腦缺血/再灌注后，腦組織TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)會增加，分別為（3.58±0.19）、（1.06±0.18）、（2.39±0.27）。黃芪可以降低TNF-αmRNA的表達(dá)（2.58±0.16），三七可以同時降低TNF-α、IL-β和ICAM-1mRNA的表達(dá)，分別為（0.65±0.11）、（1.79±0.23）。兩種藥物的配伍可以顯著抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)效果。腦缺血/再灌注后，胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少，胞核NF-κB蛋白表達(dá)增加，NF-κB的核轉(zhuǎn)為率升高。此次研究結(jié)果和鄧冰湘等人[9]的研究結(jié)果基本一致，具有研究意義。

綜上所述，該研究旨在通過研究黃芪多糖對腦缺血再灌注后TLR4/MyD88信號通路的影響的機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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[9] 鄧冰湘， 盧金冬. NF-κB信號通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及中藥有效組（成）分的干預(yù)研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2014， 34（7）：54-58.