龐廣昌，陳慶森，胡志和，解軍波

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

味覺受體及其傳感器研究與應用

龐廣昌，陳慶森，胡志和，解軍波

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

中國傳統(tǒng)飲食和食品的烹制與加工講究色、香、味俱全，其中“酸、甜、苦、辣、咸五味調(diào)和”又構成其核心標準。國際上也分為“五味”，分別為“酸、甜、苦、咸、鮮”，其中少了辣味，多了鮮味。也有人建議將脂肪的味道定義為“香”味，但是中國人的“香”實際上是“香氣”，屬于嗅覺，而非味覺。大量研究證明，多數(shù)味覺受體作為營養(yǎng)傳感系統(tǒng)，如苦、甜、鮮都屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，而且其分布并不限于味蕾、腸道等，其他組織均有分布，是藥物篩選的重要靶標。然而，到目前為止，市場上進行味覺測定仍然依賴于電子鼻和電子舌等儀器設備，味覺受體傳感器及其有關技術則仍處于探索和研究階段。其主要原因是：味覺受體和其他大多數(shù)受體一樣，在與配體識別和啟動信號傳遞時主要依賴于弱相互作用，如何將這些弱相互作用轉變?yōu)閭鞲衅骺梢蕴幚聿⒎糯蟮墓?、聲、電、磁、熱等信號，從而實現(xiàn)其定量測定是一個關鍵性難題。但是，由于味覺受體在醫(yī)藥篩選、食品添加劑、食品的功能性評價和代謝綜合征預防等方面的巨大應用與開發(fā)前景，其檢測方法一直是科學家關注的焦點之一。本文將針對味覺受體及其傳感器檢測技術的研究進展進行綜合評述，討論其未來發(fā)展和應用前景。

G蛋白偶聯(lián)受體；生物傳感器；味覺受體；電子舌

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCRs）作為一個由上千個成員構成的受體超家族，一直是科學家關注的焦點。其原因在于，它作為營養(yǎng)傳感器受體，通過胞內(nèi)復雜的信號途徑對機體或細胞的物質(zhì)代謝、能量代謝和信號交流發(fā)揮至關重要的作用[1]。不僅如此，GPCRs還通過和多條細胞信號途徑進行“Cross talking”也就是“串音”，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、細胞趨化、自吞噬、有性生殖控制等重要功能。在醫(yī)藥學領域，有40%以上的藥物是通過GPCRs為靶點而篩選得到。在食品和營養(yǎng)方面，作為主要的營養(yǎng)傳感系統(tǒng)，GPCRs則控制著生物的取食方式、營養(yǎng)吸收及其定量化和生存狀態(tài)。包括人類在內(nèi)的高等動物的視覺、聽覺、嗅覺和味覺基本上都依賴于GPCRs的傳感作用。有營養(yǎng)的物質(zhì)一般都表現(xiàn)為“愉悅的甜、鮮、咸味”，并以此作為“獎賞機制”；而抗營養(yǎng)或腐敗、有毒的成分則往往表現(xiàn)為“令人討厭的苦、酸、辣味”，以此提醒回避，并作為一種安全和防御機制。味覺系統(tǒng)還決定了進食量，一旦超過一定的限制，其“愉悅”感就會減弱或消失，而代之以“飽腹感”，甚至產(chǎn)生“厭惡”感，從而停止進食。從這個意義來看，食品科學和醫(yī)藥科學的目的都同樣是探索如何通過調(diào)節(jié)GPCRs來保證機體的營養(yǎng)攝取、吸收、控制，從而維持生物功能、維護機體健康、防御和治療疾病。

1 GPCRs的結構與功能

很多國際一流的科學家都為GPCRs的研究付出了巨大努力。研究發(fā)現(xiàn)，GPCRs都具有一個共同的七跨膜結構域、胞外結構域和胞內(nèi)結構域。其胞內(nèi)結構域非常保守，主要是用來激活G蛋白信號傳遞與放大系統(tǒng)，構成其功能基礎[2]。對其胞外結構域的比較研究證明，它們具有非常巨大的多樣性，是達爾文“正”選擇的典型代表，因而構成了不同物種獲取營養(yǎng)的途徑、方式、生存與適應不同生態(tài)位的基礎[3-4]。

GPCRs及其與配體（配基）的相互作用構成其傳遞細胞信號、發(fā)揮生物功能的基礎，因而備受關注。但是作為一種膜蛋白，其分離純化，特別是形成單晶卻一直是本領域的難題之一。盡管科學家付出了巨大努力，但是真正能夠獲得單晶從而對其空間結構進行精確解析的只有A組GPCRs成員，B組受體目前還沒有突破，C組只有個別受體獲得了高分辨率解析。然而，這些有限的研究結果已經(jīng)足以證明GPCRs和配體（基）相互作用的多樣性和復雜性，以致科學家用“分子簽名”一詞來形容[5]。既然要拿到某種GPCR的結晶并不容易，那就應該以其基因和DNA序列為突破口進行研究。事實上，這方面的研究已經(jīng)取得了巨大成功[6]。在GPCRs的味覺傳感研究方面，Nelson[7]、Zhao[8]、Li Xiaodong[9]等系統(tǒng)研究了味覺受體1型（taste receptor type 1，T1R）1和T1R3與鮮味傳感的關系，證明谷氨酸單鈉鹽、次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine monophosphate，IMP）和鳥苷酸（guanosine monophosphate，GMP）等“鮮味（人類）”的確是由T1R1＋T1R3的異二聚體進行傳感的。另外，通過人類和鼠科動物對不同氨基酸傳感及其通過味蕾細胞的瞬時感受陽離子通道家族M成員5（transient receptor potential cation channel subfamily M member 5，TRPM5）控制的鈣內(nèi)流激活作用和受試者標準化鼓索神經(jīng)響應（normalized chorda tympani responses）等，對味蕾受體激活細胞信號傳遞并通過傳入神經(jīng)傳遞脈沖信號進行味覺傳感的情況做了研究，結果表明：鼠科動物與人類在傳感“鮮味”時具有明顯的區(qū)別，鼠科動物對幾乎所有氨基酸都能傳感“鮮味”，而人類則只對谷氨酸和天冬氨酸單鈉鹽（味精）傳遞“鮮味”神經(jīng)信號[10]。而且Nelson等[7]證明：當用人類T1R1＋T1R3基因取代鼠科動物的基因以后，鼠科動物就會表現(xiàn)出和人類相同的“鮮味”傳感譜，Zhao等[8]則進一步通過在“鮮味”味蕾細胞中表達κ-阿片受體（κ-opioid receptor），證明該細胞獲得了可以傳遞阿片類成分的細胞信號；Rawal等[11]經(jīng)過比對人類鮮味受體T1R1胞外結構域的DNA序列及其與味覺的關系證明：其多樣性的確決定了不同人群之間的味覺差異。這提示味覺的傳感主要取決于受體的胞外結構域，而胞內(nèi)激活G蛋白信號放大與傳遞系統(tǒng)以及離子通道、神經(jīng)信號傳遞等途徑則是共同的，換言之，味覺感受是由受體和配基的相互作用及其在味覺組織上的分布和表達情況所“編碼”[12]。

2 味覺受體的分布與功能

味覺受體的概念本身就會毫無疑問地將這些受體局限在機體的味覺系統(tǒng)。但是，奇怪的是，近年來發(fā)現(xiàn)這些味覺受體竟然在其他器官中也有表達，而且這些“異位表達”竟是一種普遍現(xiàn)象。顯然，其功能已經(jīng)遠遠超出傳感味覺那么簡單，它們應該還有其他功能[13]，但是因為在這些部位并非通過激活神經(jīng)元將信號傳遞到大腦，所以不能感知它們的作用[14]。T1Rs（鮮味、甜味）和T2Rs（苦味）GPCRs已經(jīng)在很多組織中發(fā)現(xiàn)[7,15]。研究表明，味覺受體可能就是內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)與控制的介導者[16]。味覺信號可以調(diào)節(jié)激素分泌，而激素，如腎上腺素[17]則可以通過循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機體的能量內(nèi)平衡（energy homeostasis），包括食欲肽（orexigenic peptides）、神經(jīng)肽（neuropeptide）Y等[18-19]。這顯然意味著味覺上皮并不簡單地傳感外部信號，而是在傳遞這些信號到神經(jīng)系統(tǒng)的同時，也傳遞代謝內(nèi)分泌信號[20]。同樣，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明味覺傳感作用可能具有調(diào)節(jié)多種激素，如胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[21]、大麻素類（cannabinoids）[22]都可能受味覺受體，特別是T1Rs的調(diào)節(jié)。Lagerstrom[23]和Riera[24]等在綜述了大量文獻的基礎上提出：分布在味覺組織上的味覺受體可以將進食的成分作為味覺信號傳遞到大腦，所以可以感受到這些成分的味道；而分布在胃腸，特別是腸道系統(tǒng)的味覺受體則通過分泌胃腸激素等信號成分作用于機體的代謝與內(nèi)分泌系統(tǒng)，或者通過交感-副交感神經(jīng)系統(tǒng)作用于下丘腦、腦垂體，調(diào)節(jié)機體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)（圖1）。可見，這些受體不僅在味覺物質(zhì)，或食品添加劑的篩選、檢測和功能評價中具有重要的應用價值，在藥物篩選和功能評價方面的應用潛力也已經(jīng)引起科學界的密切關注[23]。

圖 1 不同部位味覺受體的生理功能[24]Fig. 1 Taste receptors distributed in different parts may play different physiological functions[24]

現(xiàn)代生活方式?。╩odern lifestyle diseases），特別是糖尿病和心腦血管疾病的不斷蔓延，極大地促進了低能量和無能量味覺添加劑的生產(chǎn)和銷售，并已經(jīng)使其發(fā)展成為巨大的產(chǎn)業(yè)。但是，在這個產(chǎn)業(yè)中，目前所進行的味覺（酸、甜、苦、咸、鮮）評價基本上都是通過電子舌。對這些調(diào)味品的評價方法與細胞受體無關，而實際上消費者食用這些食品后勢必存在這些味覺成分和機體內(nèi)各種相關受體之間的相互作用，從而具有一定的生理功能，而這些功能對機體的健康作用卻不能得到評價。已經(jīng)有科學家在總結了大量研究證據(jù)的基礎上，對低卡（卡洛里）或無卡甜味劑的生理作用及其安全性提出質(zhì)疑和擔心[25]，盡管也有人認為這些低卡和無卡甜味劑對糖尿病和心腦血管疾病患者是安全的[26]。不過人們?nèi)匀徊荒芑乇苓@些味覺物質(zhì)在體內(nèi)通過與其受體相互作用所產(chǎn)生的代謝、生理與內(nèi)分泌作用。鮮味添加劑或鮮味物質(zhì)的研究也已經(jīng)形成巨大的產(chǎn)業(yè)，在整個餐飲和食品加工制作、烹飪等行業(yè)中發(fā)揮舉足輕重的作用。已知“鮮味”和氨基酸、肽類以及嘌呤成分密切相關[27]，盡管IMP和GMP作為鮮味物質(zhì)，與嘌呤代謝疾病有一定的聯(lián)系，但是氨基酸和呈味肽類產(chǎn)品的研究與開發(fā)已經(jīng)成為功能性食品、營養(yǎng)添加劑和調(diào)味品研究的熱門領域。而大量的研究證明，這些氨基酸、短肽類營養(yǎng)成分和核苷酸類成分都是通過和鮮味受體T1R1＋T1R3相互作用進行味覺傳感并發(fā)揮生理功能[28]，所以毫無疑問，能夠?qū)Α磅r味”受體進行系統(tǒng)化和定量化研究具有重要的理論意義和應用價值。

2.1 鮮味受體及其分布與功能

氨基酸和呈味核苷酸可以產(chǎn)生鮮味，鮮味可以讓人感受到食物可口的味道，是由日本科學家發(fā)現(xiàn)的第5種基本味覺感受。由T1R1和T1R3組成的異二聚體是鮮味的味覺受體，T1R1/T1R3主要在舌前部的菌狀乳突味蕾內(nèi)的Ⅱ型細胞中共表達[7]。另外一種鮮味受體是代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR），人在服用該受體的抑制劑之后，舌咽神經(jīng)和鼓索神經(jīng)對谷氨酸鈉鹽產(chǎn)生的興奮被顯著抑制，說明mGluR主要在舌后部分布，并介導谷氨酸鈉鹽產(chǎn)生的鮮味味覺[29-30]，該受體不對其他核苷酸和氨基酸敏感。在鼠科動物中，T1R1/T1R3異二聚體對20 種L-氨基酸都有著較寬的傳感范圍，并且，氨基酸與呈味核苷酸的共同作用能使人感覺到強烈的鮮味協(xié)同增強效應。小鼠T1R1或T1R3單基因敲除后對谷氨酸鈉鹽的感知能力減弱[8]，T1R1/T1R3雙基因敲除后則喪失了對于鮮味味道的感受能力[31]。人類的味覺只能品嘗到兩種氨基酸（天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽）產(chǎn)生的鮮味，而很多的動物實驗表明，哺乳動物可以對幾乎所有L-氨基酸產(chǎn)生喜好感。人類和動物間經(jīng)過不斷進化，已經(jīng)在大自然中處于不同的生態(tài)位，造成不同物種鮮味傳感機制的差異、營養(yǎng)傳感和偏好上的多樣性。

T1R1是膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體C家族，胞內(nèi)與Gα、Gβ和Gγ3個亞基相偶聯(lián)。味覺物質(zhì)與受體結合后，導致受體的構象變化，使Gα和Gβγ亞基分離，Gα和Gβγ被激活后分別介導各自的下游信號途徑，受體-配體結合產(chǎn)生的信號利用細胞內(nèi)的級聯(lián)放大系統(tǒng)進行信號放大，并活化細胞表面的離子通道，促進鈣離子內(nèi)流，將細胞產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)釋放到細胞外。Wauson等[32]系統(tǒng)研究了T1R1/T1R3的分布，證明該受體幾乎分布在所有的組織、器官和細胞中。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（the mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）能夠集成營養(yǎng)信息，特別是氨基酸營養(yǎng)，從而對蛋白質(zhì)合成和細胞生長發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。當氨基酸缺乏（饑餓）時，mTORC1通過激活自吞噬作用為最重要的蛋白質(zhì)合成提供氨基酸保證。文獻[32]用大量的實驗證明T1R1/T1R3作為食物中氨基酸狀態(tài)和可利用程度的傳感系統(tǒng)將信號傳遞給mTORC1，干擾T1R1/T1R3受體的信號傳遞可以改變mTORC1的細胞定位。下調(diào)該信號途徑抑制因子的表達可以上調(diào)關鍵性氨基酸的運載體，阻斷翻譯起始，誘導自吞噬作用。這些發(fā)現(xiàn)證明了T1R1/T1R3作為氨基酸傳感器實現(xiàn)氨基酸營養(yǎng)狀態(tài)和mTORC1之間的通訊，在氮源傳感、吸收和代謝方面發(fā)揮重要功能（圖2）。

2.2 甜味受體及其分布與功能

甜味受體是由T1R2構成，和鮮味受體共用T1R3，亦即以異二聚體的形式傳感甜味信號[15,33]。甜味受體作為GPCRs超家族成員，也在其他組織、器官和細胞中表達，如呼吸道[34]。已經(jīng)有證據(jù)表明甜味受體可能涉及免疫調(diào)節(jié)和應答[35]。甜味受體也表達在胃腸道，如腸內(nèi)分泌L-細胞和K-細胞，通過分泌GLP-1和葡萄糖依賴性促胰島素肽（glucose-dependent insulinotropic peptide）發(fā)揮生理作用。腸絨毛頂部的這些細胞暴露到腸腔中攝取葡萄糖等甜味營養(yǎng)，同時激活甜味受體，刺激胰島素的分泌[35]，這些胰島素統(tǒng)一受胰島β-細胞的統(tǒng)籌與控制。甜味受體也可以上調(diào)小腸上皮細胞葡萄糖運載體的表達，增加葡萄糖的吸收和運輸[36]。有研究認為，甜味受體在各種類型細胞表達實質(zhì)上是一種控制糖代謝的機制。所以，甜味受體表達于胰島的β-細胞[37]、脂肪細胞[38]和下丘腦葡萄糖響應神經(jīng)元[39]。這些研究結果顯然提出一個必須面對的問題：人工甜味添加劑是否也能發(fā)揮這些作用？至少應該弄清楚這些問題[40]。已經(jīng)有大量研究證明，不像葡萄糖之類的能量甜味劑那樣，人工甜味劑不能增加胰島素或腸降糖素的釋放[25]。例如，Anton等[41]報道：飲食添加蔗糖的茶、乳酪或餅干后測定其體內(nèi)的胰島素水平明顯高于以阿斯巴甜或甜葉菊作為甜味劑的同樣食品。另一項研究也表明在飯前食用天然甜味劑-蔗糖或三氯蔗糖，然后進餐同量的土豆，食用三氯蔗糖者的胰島素、GLP-1或腸抑胃肽（gastric inhibitory polypeptide，GIP）并不升高，而蔗糖食用者則明顯升高[42]。其原因可以解釋為：蔗糖在腸道里和三氯蔗糖具有明顯不同的生理作用，而這些生理作用是由于它們和受體作用及其激活的信號途徑不同（圖2）。

2.3 苦味受體及其分布與功能

“苦味”作為五味之一，最顯著的特點就是閾值極低，許多苦味物質(zhì)不僅可以賦予食品苦味，還有降血壓、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功能[43]。生活中苦味也是不可或缺的，當它與其他味感調(diào)節(jié)得當時，能起到改善食品風味的作用[44]。膳食中的苦味成分，特別是植物性多酚、黃酮類化合物，都有抗氧化、降低心血管疾病和腫瘤發(fā)病率的作用，所以常常被稱作“植物營養(yǎng)素”，而且隨著人們對苦味物質(zhì)的認識，苦味食品也開始受到人們的關注[45]?，F(xiàn)在苦味受體T2Rs已經(jīng)被鑒定出來，且也是GPCRs超家族成員，這種受體對很多苦味物質(zhì)都有響應，例如存在于食物和藥物中的苦味物質(zhì)主要包括：生物堿、萜類、糖苷類和苦味肽類，另外還有膽汁、某些氨基酸等。T2Rs受體作為哮喘病治療藥物的篩選靶點已經(jīng)受到研究人員的廣泛關注[46]。作用于苦味受體的化合物可以促進細胞的鈣離子內(nèi)流，從而舒緩平滑肌，減少哮喘患者呼吸道阻塞。這同時也促使科學家對該受體味覺以外的分布進行了調(diào)查，并已經(jīng)證明其分布廣泛，特別是在呼吸道[47-49]。所以有人提出，分布在呼吸道中的苦味受體通過味覺依賴性Gβγ作用于電壓依賴性鈣通道（the voltage-dependent Ca2＋channels）發(fā)揮活化鉀離子通道的作用[49]，這也是很多抗過敏、抗哮喘藥物都很苦的重要原因。中國人一直認為“良藥苦口利于病”其原因可能正是由于苦味受體的作用（圖2）。

圖 2 鼠科動物苦、甜、鮮味受體及其傳感作用[50]Fig. 2 Taste receptors and transduction in murine animals[50]

2.4 辣味受體及其分布與功能

辣味作為“五味”之一在以中國人為代表的東方國家中占據(jù)重要地位。但是，在西方人的“五味”中沒有辣味，也許正因如此，至今沒有測定辣味的電子舌上市。不過辣味受體早已作為痛（熱）覺傳感受體被發(fā)現(xiàn)[51]，辣椒素就是這種受體的激活劑。辣味傳感主要是通過激活瞬時感受器電位香草素受體亞家族（the transient receptor potential vanilloid subtype ion channel，TRPV）1從而激活離子通道。隨后大量的研究集中在以該受體為靶標進行止痛藥物的篩選研究方面[46]，其檢測方法也基本上依賴于該受體所造成的離子通道上的變化[52]。本課題組利用大鼠味蕾組織進行固定化，研制出一種新型電化學型辣味受體傳感器，其檢測限達到1×10－13mol/L，并可以進行動力學分析，真正實現(xiàn)了對辣椒素發(fā)揮辣味作用的定量化評價[53]。

辣味受體（capsaicin receptor）-TRPV1也被定義為傷害性受體，同樣可以被胞外質(zhì)子激活[54]。毫無疑問，傳入神經(jīng)對辣味和酸味等傷害性受體傳感發(fā)揮重要作用。辣味受體的作用受炎癥細胞因子的激活，對酸性pH值、高溫也非常敏感（圖3）。所以概括起來，TRPV1傳感辣味、酸味和高溫。

圖 3 辣味受體TRPV1及其與激活因子的相互作用[55]Fig. 3 TRPV1 channel subunit and interaction sites for several TRPV1 activators[55]

2.5 咸味受體及其分布與功能

咸味的研究雖然很早，但是否存在咸味受體直到2010年才塵埃落定。在鼠科動物中，咸味（食鹽）傳感有兩種機制：一種對利尿劑阿米洛利（amiloride）敏感，另一種機制就是對阿米洛利感覺遲鈍[56]。對于人類，咸味沒有阿米洛利利尿敏感性。動物對低濃度食鹽的作用與上皮Na＋通道（ENaCs）相聯(lián)系，也有人認為低鹽受體就是Na＋通道[57]。ENaC是由α、β、γ 3個亞基構成，它們形成孔狀結構，發(fā)揮鈉離子通道的作用。ENaCα被敲除后可以減少動物對低鹽溶液的敏感性[58]。對高鹽濃度的傳感就更加復雜，根據(jù)神經(jīng)信號傳遞情況可以看到，很多都表現(xiàn)出對KCl和NaCl的敏感性[59]。傳遞咸味信號的神經(jīng)纖維主要分布在舌頭的背腹部。到目前為止，對于高鹽傳感受體仍然莫衷一是。也曾經(jīng)有人提出高鹽傳感受體實際上就是辣味受體TRPV1[60]，但是后來又被否定了[59]。顯然，介導高鹽傳感的細胞并不是特異性的，至少有兩個細胞群，它們既可以傳感苦味，也可以傳感酸味[61]。對苦味傳感細胞的TRPM5或磷酸肌醇特異性磷酸酯酶Cβ2（phosphoinositide-specific phospholipase Cβ2，PLCβ2）滅活后，同時對高鹽傳感也會消失，但是酸味細胞多囊性腎病2樣1基因（polycystic kidney disease 2-like 1，PKD2L1）不表達時，其他部件也被消除[62]。顯然，小鼠細胞關閉PKD2L1基因表達以及TRPM5滅活后仍然保持對高鹽的吸引，這有可能是通過阿米洛利敏感性通道實現(xiàn)的[63]。到底多大鹽濃度可以激活這兩種類型的細胞并不完全清楚。高鹽也可以通過這種受體的變構作用激活苦味傳感細胞，而酸味傳感則需要其細胞頂部環(huán)境通過高鹽溶液改變酸堿平衡[58]。Chandrashekar等[58]通過系統(tǒng)的實驗證明咸味作為對NaCl攝取的一種“獎賞”，實際上是通過上ENaC作為咸味傳感受體（圖4）。而該受體如何通過和NaCl相互作用控制細胞內(nèi)的信號途徑，以及受體-配體結構與功能及其量效關系尚需深入研究。迄今為止，只發(fā)現(xiàn)低鹽溶液對哺乳動物具有吸引作用，而且適量的NaCl是動物生理活性所必需。但是，過高濃度的食鹽對機體也會產(chǎn)生傷害作用，高濃度的食鹽是否也是通過受體傳感，如果是，那會是什么受體尚需探索和研究。

圖 4 哺乳動物咸味受體[58]Fig. 4 The salt taste receptors in mammals[58]

2.6 酸味受體及其分布與功能

酸味受體[62]：動物對酸味的傳感主要是靠舌頭和上顎上皮上的味覺受體細胞。它們可以對酸性pH值和弱有機酸作出電化學響應[63]。在過去若干年，研究者假設了多種負責傳感酸味的受體，包括ASICs、HCNs、K＋通道，以及近來的TRP通道PKD2L1和PKD1L3[64]。這些假設往往被基因敲除實驗所否定。例如敲除老鼠的PKD2L1或PKD1L3基因后，其傳感酸味刺激的神經(jīng)脈沖只有微量的衰減[65]。盡管如此，細胞表達PKD2L1仍然是其傳感酸味所需要的[61]。顯然，有關基因敲除實驗的邏輯推理是值得懷疑的，當有不止一個基因傳感同一種味道時，敲除其中任何一個基因都不會影響其他受體對該味道的傳感，因為其他基因會取而代之。細胞表達PKD2L1對酸味作出響應是通過質(zhì)子選擇通道（proton-selective ion channel）進行[66]。該質(zhì)子選擇通道在對酸作出響應時不受Na＋的干擾。至于該質(zhì)子通道的分子基礎尚未得到鑒定。當質(zhì)子進入酸味傳感細胞后會促使其酸化，從而產(chǎn)生細胞信號傳遞。值得注意的是，味覺細胞表達一系列靜息雙孔鉀離子通道（resting two-pore K＋channel）[67]，這些通道可能被細胞內(nèi)酸化作用所阻斷，從而使細胞進一步去極化。另外，TRPA1是一種“傷害性受體（nociceptor）”也可以對乙酸作出響應[68]（圖5）。哺乳動物對酸味的傳感實際上是通過質(zhì)子選擇性離子通道的頂部進入所發(fā)出的信號。弱酸也可能通過穿入細胞膜使胞漿酸化從而導致鉀離子通道關閉，產(chǎn)生膜的去極化作用，激活酸味傳感細胞。

圖 5 酸味受體[68]Fig. 5 Sour taste receptors[68]

總之，味覺受體除辣味受體不屬于GPCRs外，其他如鮮味、甜味、苦味都屬于GPCRs，咸味和酸味傳感比較復雜，只有微咸的受體比較明確，不屬于GPCRs。酸味主要是通過離子和質(zhì)子通道來傳遞損傷性信號，也不屬于GPCRs。不過，這些受體都與胞內(nèi)小G蛋白（small G proteins）有復雜的關系，其細胞信號傳遞的詳細機制有待深入研究。

3 味覺受體傳感的測定方法

在味覺受體的檢測方面，由于生物化學及分子生物學對味覺信號傳遞以及作用機制，特別是醫(yī)藥科學領域以GPCRs作靶標進行藥物篩選的需要，對其與配體（基）相互作用規(guī)律及其激活/抑制劑作用規(guī)律方面進行了大量研究，并已經(jīng)取得了舉世矚目的進展[69]。這些技術主要是基于GPCRs與配基作用所產(chǎn)生的細胞生理變化，如對離子通道的作用[70]所產(chǎn)生的神經(jīng)脈沖信號（多用于嗅覺信號編碼與傳遞）[71]、針對分子互作的表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）[72]，以及適于高通量細胞微孔篩選平臺（microtiter plate-based high-throughput screening platforms）和活細胞微操作（live-cell screening assays）技術，包括細胞微陣列（cell microarrays）、細胞微流（cell microf l uidics）等[73]。遺憾的是，這些技術往往只適用于某一特定的目的，難以實現(xiàn)真正意義的定量化。

雖然有不少科學家致力于味覺受體傳感器的研究，而且在受體與配體互作所產(chǎn)生的光[74]、聲[29]、電[75]、熱[76]變化的基礎上進行味覺受體傳感器的研究與開發(fā)，但這些研究基本上仍然是基于活細胞受體與配體（基）互作所產(chǎn)生的Ga2＋內(nèi)流等離子通道的變化[77]，而這些變化都依賴于細胞的種類、生理活性、所處的環(huán)境、細胞之間的相互作用、細胞內(nèi)信號傳遞途徑及其“串音（crosstalking）”、各種離子通道之間的控制和狀態(tài)等復雜因素，因此尚處于探索階段。已經(jīng)進入市場的基于SPR技術的分子互作儀雖然可以用來進行非標受體-配體互作檢測[78]，但是因其難以實現(xiàn)高通量、技術要求復雜、操作精細、成本高，難以實現(xiàn)常規(guī)的“味覺”檢測。

值得一提的是，Duan Xuexin等[79]在SPR技術的基礎上發(fā)明了一種硅納米線形成電場效應晶體管技術（silicon nanowires conf i gured as f i eld-effect transistors，Si-NW FETs），該技術可以用作親和性生物傳感器，實現(xiàn)蛋白-受體之間親和性和動力學測定。該技術主要可用于大分子之間的相互作用，但是難以用于味覺受體與味覺成分的測定，因為味覺物質(zhì)不僅多種多樣，而且大多數(shù)都是各種有機分子，如糖、核苷酸、氨基酸、芳香族化合物（如苦味）等，同時也有短肽、糖類衍生物，甚至很多金屬離子也有味覺。另一方面，這類物質(zhì)似乎并非僅僅通過與受體之間的親和作用發(fā)揮傳感功能，所以SPR或者Si-NW FET都難以實現(xiàn)味覺受體-配體作用的定量化測定。

4 電子舌測定味覺成分

在食品營養(yǎng)、調(diào)味和感官評價領域，其檢測方法主要集中在以感官為基礎的電子鼻和電子舌技術的研究與應用，目前已經(jīng)有各種儀器、設備上市。但是此類傳感器主要是開發(fā)具有對味覺或嗅覺成分作出響應的材料（膜、電極或粒子），從而根據(jù)不同人群的感官評價指標進行比對和定量化。這種定量化實質(zhì)上仍然是一種對味覺成分濃度的測定，其優(yōu)點是重復性好、不需要對味覺物質(zhì)進行預處理、成本較低等；但是缺點也很明顯，與真正的味覺傳感、神經(jīng)、生理作用沒有直接聯(lián)系。

5 味覺受體傳感器研究進展

雖然對嗅覺受體，特別是昆蟲觸角上的嗅覺受體進行微型傳感器的研究已經(jīng)取得了很多重要進展[71]，但是在味覺受體傳感器研究，特別是電化學型味覺受體傳感器方面則很少有成功的報道。Chen Peihua等[80]將具有酸味傳感受體的細胞進行培養(yǎng)，用光尋址傳感器（lightaddress able potentiometric sensor，LAPS）識別酸味刺激并與無酸溶液作比較，酸味傳感受體細胞經(jīng)受酸味刺激以后就會改變其動作電位，并可通過LAPS對這些細胞外的信號進行記錄。經(jīng)過對這些信號進行一段時間的分析和提取，過濾掉與味覺受體無關的信號后即可以對味覺受體的作用進行研究。用這種方法所得到的信息雖然可能與味覺受體對味覺刺激相關，但是，由于其細胞的狀態(tài)、細胞和細胞之間的相互作用以及胞內(nèi)信號途徑的復雜“Cross-talking”，難以得出味覺受體和味覺刺激的動力學規(guī)律，更難以進行精確的味覺測定和評價。

到目前為止，對味覺傳感的定量化方法實質(zhì)上是基于3 種機制之一：1）基于活細胞離子通道或細胞活性成分的標記；2）所謂非標-SPR法，主要是通過測定受體-配體之間的結合與解離特性；3）電子舌，主要是基于人們對若干基本味覺物質(zhì)的品嘗經(jīng)驗對味覺物質(zhì)作用于敏感材料所產(chǎn)生的電化學響應進行味覺評價。第3種機制與細胞受體無關，而第1種機制必須面對復雜的細胞內(nèi)不同信號途徑之間的“Cross-talking”以及細胞本身的狀態(tài)等復雜因素的影響，而第2種機制不僅要克服如何實現(xiàn)高通量、降低成本等問題，其測定結果也需要持審慎的態(tài)度。因為味覺受體對味覺物質(zhì)，特別是小分子物質(zhì)，例如對酸味（pH值）、咸味的傳感似乎與受體-配體之間的結合-解離作用沒有直接關系。

本課題組自1996年至今，在生物傳感器研究方面進行了10多年的探索，特別是在納米免疫傳感器的研究方面取得了較大突破。本課題組以交聯(lián)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的電子媒介體硫堇-殼聚糖為橋聯(lián)劑，吸附納米金于玻碳電極，借助納米金吸附固定HRP制備了H2O2生物傳感器。利用計時電流法對H2O2進行測定，結果表明該生物傳感器檢測的線性范圍為1×10－7～1×10－4mol/L，檢測限為5.0×10－8mol/L。其壽命、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及選擇性都表現(xiàn)突出[81]。在此基礎上，本課題組以殼聚糖作為橋聯(lián)劑連接金納米粒子于玻碳電極，用納米金固定HRP標記的抗牛免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）構建了檢測牛IgG的電化學免疫傳感器。通過交流阻抗法和循環(huán)伏安法表征電極組裝過程的電化學特性，用電流-時間法測定PBS緩沖液稀釋的標準牛IgG。結果顯示，免疫反應前后穩(wěn)態(tài)電流的變化率與牛IgG的質(zhì)量濃度的對數(shù)在10－1～104ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性相關，相關系數(shù)為0.997 6。該傳感器重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好、成本低、操作簡單，可用于含牛免疫球蛋白樣品的定量檢測[82-83]。以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蠟樣芽孢桿菌BALB/c單克隆抗體，以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-HRP復合物固定于上述電極并吸附抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體構建了雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學免疫傳感電極。利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法等表征電極組裝的各個階段，利用計時電流法對蠟樣芽孢桿菌進行測定，結果顯示，該傳感器的響應電流與菌濃度在5×101～5×104CFU/mL范圍內(nèi)呈線性關系，相關系數(shù)為0.996 6，檢測限為10 CFU/mL[84]，為實現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌的快速定量和在線檢測奠定了基礎。

該技術的重要意義在于建立了一個用于結合BALB/c小鼠單克隆抗體的納米免疫傳感器及其辣根過氧化物酶信號放大系統(tǒng)。事實上，免疫球蛋白本身就是B-細胞受體（B cell receptor，BCR）經(jīng)過轉型開關作用轉變成抗體，它和抗原之間的互作與受體和配體之間的互作基本上是相同的。因此有理由推測：既然可以把抗體-抗原之間的弱相互作用轉變?yōu)殡娀瘜W信號，那么也應該可以將其他受體和配體之間的信號轉變?yōu)殡娀瘜W信號從而研制出電化學型受體傳感器。于是本課將這一信號放大系統(tǒng)用于電化學型味覺受體傳感器的研究，并取得了突破性進展。一方面將該放大系統(tǒng)用于小鼠GPR70受體（T1R1，NCBI編號：AF337040.1）鮮味電化學生物傳感器的研究，另一方面利用Oligo法進行基因合成，酶切法連接至真核表達載體pcDNA3.1，轉化DH5α菌株獲得質(zhì)粒載體，再使用脂質(zhì)體轉染法轉染至CHO-K1細胞，培養(yǎng)并表達，獲得了目的受體蛋白-GPR70。然后利用該受體胞內(nèi)結構域中的多個巰基和納米金-硫堇-殼聚糖連接，通過HRP進一步放大該受體胞外結構域與配基之間的相互作用的信號，研制出鼠GPR70電化學型鮮味傳感器，經(jīng)實際檢測表明：該鮮味受體傳感器能夠?qū)劝彼徕c和多種TCA代謝中間化合物（5×10－14～7×10－12mol/L）進行測定，呈現(xiàn)酶-底物相似的雙曲線動力學方程，于是按雙曲線進行回歸，相關系數(shù)為0.974 5；在谷氨酸鈉濃度為5×10－14～1×10－12mol/L時，谷氨酸鈉濃度和檢測信號的差值呈線性關系，相關系數(shù)為0.991 5；通過雙倒數(shù)法對實驗結果進行回歸分析，受體-配基相互作用濃度/活性常數(shù)（達到最大活性一半時的配體濃度）為1.316 4×10－12mol/L。該方法的優(yōu)點是用固定的納米-辣根過氧化物酶替代細胞內(nèi)的信號通路和信號放大系統(tǒng)，從而避免了細胞內(nèi)復雜的信號途徑之間的“Crosstalking”，容易實現(xiàn)高通量，但是缺點也很明顯：不能反映受體在流動性的細胞膜上的相互作用以及細胞內(nèi)通過細胞信號傳遞和多條信號途徑之間的“Cross-talking”所產(chǎn)生的真實生物學效應。

為了能夠更加真實地檢測受體-配體互作所產(chǎn)生的真實生物學效應，對上述納米受體傳感器所檢測的規(guī)律與固定化大鼠味蕾組織所構建的味覺生物傳感器進行了比較，結果表明：這兩種傳感器顯示出十分相似的靈敏度和動力學特征[53]。通過這兩種受體傳感器，不僅可以比較人工信號放大系統(tǒng)和細胞信號放大系統(tǒng)之間的關系，還能夠由此定量化研究受體與配基之間的互作動力學，甚至構效關系[85]，實現(xiàn)通過目前最成熟、最普遍的電化學型傳感器定量化測定味覺的目的。對組織或細胞受體傳感器的設計和測定原理如圖6所示。當對不同濃度的待測分子進行測定時，相當于向傳感系統(tǒng)中輸入配體信號X，則可以測定到系統(tǒng)的輸出信號Y，于是可以得到Y和X的函數(shù)關系，這一函數(shù)關系表達了受體-配體之間的相互作用、受體在細胞膜上的相互作用、繼而所產(chǎn)生的胞內(nèi)信號放大和傳遞途徑以及由此所產(chǎn)生的總體生物學效應。當然其前提是X和Y之間有函數(shù)關系（例如：相關性）。顯然，這里X和Y是自變量和因變量之間的關系，也就是因果關系，是不可逆的，當然不排除正反饋或負反饋作用。該傳感器不僅可以用來進行味覺、嗅覺測定，預計在藥物篩選、功能性食品評價等方面具有極廣泛的應用前景。

圖 6 細胞作為信號放大系統(tǒng)對味覺受體傳感信號測定示意圖Fig. 6 Schematic diagram of a taste receptor sensor based on cells as signal amplif i cation system

6 結 語

味覺受體構成人和動物對環(huán)境和營養(yǎng)的傳感與控制，不僅存在與味蕾等味覺組織，幾乎分布于機體所有的器官、組織和細胞。之所以人體感覺不到它們存在于味覺以外的組織，是因為只有味覺組織所傳感的信號傳遞到大腦，其他如腸道受體主要是傳遞到下丘腦或腦垂體，通過代謝和內(nèi)分泌作用調(diào)節(jié)營養(yǎng)的吸收、運輸、貯存、分解和內(nèi)分泌，同時也調(diào)節(jié)攝食量、飽腹感和食欲。目前對味覺測定商品化的儀器設備主要是電子舌或電子鼻，實際上是對味覺成分的測定，跟味覺受體沒有直接關系。而大量實驗結果證明：味覺受體在味覺成分的作用下具有非常重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)、生理、免疫和內(nèi)分泌等功能。而如果人工調(diào)味劑對機體的生理、代謝和內(nèi)分泌具有不同的作用，甚至有害，那么其潛在的健康問題就值得關注，可見味覺受體傳感器的研究極具迫切性。

事實上，味覺受體早就引起了科學家的密切關注，因為大多數(shù)嗅覺和味覺受體都是GPCR超家族成員，是藥物篩選最重要的靶點。但是由于受體-配體之間的相互作用非常復雜，而且多屬于弱相互作用，難以轉化為電信號進行測定。所以到目前為止，研究主要是基于在味覺受體接受到配體的抑制劑、激活劑刺激時細胞所產(chǎn)生的離子通道或分泌物的變化，這些變化可以通過各種分子標記來進行定量化測定。最近，由于SPR技術的成熟與儀器設備的市場化，通過該技術進行非標受體-配體互作測定已經(jīng)吸引了眾多科學家的目光。但是，這些研究主要是為了進行非標篩選藥物，鮮見用于味覺測定的報道。

在味覺受體電化學傳感器的研究方面只有很少的報道。Chen Peihua等[80]通過將酸味受體細胞培養(yǎng)并吸附在印刷絲網(wǎng)電極構成的培養(yǎng)板上，通過光尋址技術測定加入酸味物質(zhì)所產(chǎn)生的信號變化，在數(shù)據(jù)處理時過濾掉與酸味物質(zhì)響應無關的信號，研制出酸味受體傳感器，但是該傳感器的干擾因素多而且復雜，難以實現(xiàn)精確的定量測定。

本課題組成功地將抗原-抗體之間的弱相互作用轉化為電化學信號，從而在研制出電化學型納米金免疫傳感器的基礎上，將該技術用于受體傳感器的研究，將大鼠體外表達的T1R1鮮味受體蛋白自組裝到納米金上，通過辣根過氧化物酶進一步放大信號，制成可以定量測定鮮味物質(zhì)-谷氨酸單鈉鹽的電化學型傳感器。該傳感器結合固定化組織或細胞傳感器技術，可以為鮮味物質(zhì)，包括氨基酸、肽類、IMP和GMP及其與味覺受體作用規(guī)律、生物功能評價等研究提供高敏感、特異性、定量化、操作簡單、價格便宜、重復性好的檢測方法。該技術的建立與完善將有望為極具多樣性的GPCRs及其與配基（體）互作規(guī)律、信號途徑、生物學功能等研究提供一個通用的技術平臺，同時可以用于人類和動物的味覺測定。

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Advances in Research on Taste Receptors and Application Prospects of Taste Sensors

PANG Guangchang, CHEN Qingsen, HU Zhihe, XIE Junbo
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The color, smell and taste with perfect blend of the fi ve basic fl avors namely sourness, sweetness, bitterness, spice and saltiness as core criterion are three aspects to describe traditional Chinese diet and food cooking and processing. The internationally recognized fi ve tastes are identical to the Chinese ones except for the replacement of spice by umami. It is suggested that the taste of fat be def i ned as “aroma”, but the Chinese “aroma” belongs to the sense of smell, rather than the sense of taste. Accumulated evidences have demonstrated that the majority of taste receptors as a nutrient sensing system, such as bitterness, sweetness and umami, which have been used as the target for drug screening, belong to the super family of G protein coupled receptor, and its distribution is not restricted to the taste buds, intestinal tract and other tissues. Although a lot of achievements have made in the study of taste receptors, but so far, the instrumental determination of taste still depends on electronic nose and electronic tongue. Taste receptor-based biosensors and related technologies are still under exploration and research. The major reason is due to the effects of all receptors including taste receptors with weak interaction with their ligands. How to transform the weak interaction into signals such as light, sound, electric, magnetism and heat, which can be handled and amplif i ed by sensors to realize quantitative measurement, is a critical problem. Because of the great prospects for the development and application of taste receptors in medical screening, functional evaluation of foods and additives, and the prevention of metabolic syndromes, developing detection methods based on using taste receptors is always one of the research focuses. This article aims to provide a systematic review of recent advances in our knowledge about taste receptors and in the development of taste receptor-based biosensors. The prospects for their future application are discussed as well.

G-protein-coupled receptors (GPCRs); biosensor; taste receptors; electronic tongue

10.7506/spkx1002-6630-201705047

R151.41

A

1002-6630（2017）05-0288-11

龐廣昌, 陳慶森, 胡志和, 等. 味覺受體及其傳感器研究與應用[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 288-298. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705047. http://www.spkx.net.cn

PANG Guangchang, CHEN Qingsen, HU Zhihe, et al. Advances in research on taste receptors and application prospects of taste sensors[J]. Food Science, 2017, 38(5): 288-298. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705047. http://www.spkx.net.cn

2016-06-26

國家自然科學基金面上項目（31371773）

龐廣昌（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術和生物傳感器。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn