于 洋，于文皓，晏嘉澤，董 浩，董家耕，靳 艷,*，祁艷霞

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；3.遼寧輝山生物科技研究有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110031）

基于LC-MS/MS的酸乳肽譜及ACE抑制活性

于 洋1,2，于文皓1,2，晏嘉澤2，董 浩2，董家耕3，靳 艷2,*，祁艷霞1,*

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；3.遼寧輝山生物科技研究有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110031）

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的方法，對(duì)4 種酸乳（優(yōu)味舒風(fēng)味發(fā)酵乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、初乳24＋K風(fēng)味發(fā)酵乳和十天風(fēng)味發(fā)酵乳）的肽譜進(jìn)行分析，分別鑒定到152、125、364 條和274 條肽段。利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制活性比較以上4 種酸乳的生物活性，在相同質(zhì)量濃度2.0 mg/L時(shí)，4 種酸乳ACE抑制率分別為46.84%、42.75%、77.41%和63.84%。初乳24＋K風(fēng)味發(fā)酵乳含有肽的數(shù)量大、ACE抑制活性高可能與其獨(dú)特的原料成分相關(guān)。對(duì)4 種酸乳的肽譜及ACE抑制活性的考察，為進(jìn)一步研究酸乳肽的功能特點(diǎn)和ACE抑制活性提供了理論依據(jù)。

酸乳；肽譜；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；ACE抑制活性

酸乳是一種公認(rèn)的健康食品，是牛乳通過(guò)乳酸菌發(fā)酵制成的具特殊風(fēng)味的乳制品。在酸乳發(fā)酵過(guò)程中，有20%左右的蛋白質(zhì)在乳酸菌的作用下被分解成為小肽和氨基酸等，其中乳酸菌及其分解產(chǎn)物能產(chǎn)生特殊的保健功效，如預(yù)防心腦血管疾病、維持改善胃腸道菌群平衡、抗衰老等[1-2]。酸乳中的益生素、VD和鈣對(duì)降低2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有積極影響[3]，大量攝入酸乳及其他乳制品可降低2型糖尿病發(fā)病幾率[4]。因此酸乳是一種很好的提高機(jī)體免疫能力、調(diào)節(jié)機(jī)體生理代謝功能的營(yíng)養(yǎng)保健食品。

研究表明酸乳中的生物活性肽具有血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等活性[5]。ACE是一種在血壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的酶[6]，已從牛乳[7]、發(fā)酵乳[8-9]和奶酪[10]中發(fā)現(xiàn)具有降血壓功能的ACE抑制肽。崔磊等[11]使用了凝膠層析分離純化低分子質(zhì)量肽的方法研究了國(guó)內(nèi)6 種市售酸乳中的ACE抑制活性，6 種酸乳均顯示具有ACE抑制活性。牛乳中的蛋白質(zhì)在乳酸菌的作用下產(chǎn)生長(zhǎng)短、活性各異的肽，目前常規(guī)的分析方法已無(wú)法準(zhǔn)確反映酸乳中的肽組成及其活性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是一種高通量的分析方法，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，LC-MS/MS越來(lái)越普遍地應(yīng)用于藥物、食品等多個(gè)領(lǐng)域，也被應(yīng)用于分析鑒定酸乳中的肽[12]。為了解不同酸乳的肽組成與生物活性之間的差異以及這種差異與酸乳原料和菌種之間的相關(guān)性，利用LC-MS/MS研究了4 種市售酸乳的肽譜，研究4 種酸乳的ACE抑制活性，并對(duì)其肽譜及活性肽進(jìn)行了分析和比較，以期為酸乳肽譜及活性的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸乳：輝山乳業(yè)出品優(yōu)味舒風(fēng)味發(fā)酵乳（YWS），風(fēng)味發(fā)酵乳（FW），初乳24＋K風(fēng)味發(fā)酵乳（CR24＋K）和十天風(fēng)味發(fā)酵乳（ST）購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校?甲酸（formic acid，F(xiàn)A） 美國(guó)Fluka公司；乙腈（acetonitrile，ACN，色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Thermo公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、ACE模擬底物N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl) acryloyl]-L-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG）、兔肺丙酮粉（lung acetone powder from rabbit） 美國(guó)Sigma公司；Magic C18AQ反相色譜填料（5 μm，12 nm） 美國(guó)MichromBioRecources公司；石英毛細(xì)管 美國(guó)Polymicro Technologies公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Finnigan Surveyor液相色譜泵、組合型離子阱軌道阱質(zhì)譜儀（LTQ Orbitrap XL）配有納升電噴霧離子源及Xcalibur2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、SpeedVac真空冷凍干燥機(jī)美國(guó)Thermo公司；Synergy H1全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；Milli-Q超純水一體機(jī) 美國(guó)Millipore公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取酸乳樣品100 mL，加入50 mL pH 2.0、35 mmol/L NaCl溶液，218×g均質(zhì)10 min。然后12 235×g、4 ℃條件下離心20 min，收集上清液。由于多肽的分子質(zhì)量一般在10 kD以下，上清液用10 kD超濾管超濾，12 235×g、室溫條件下離心20 min，收集濾液，用于ACE活性檢測(cè)。

1.3.2 樣品的預(yù)處理

中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制的C18SPE預(yù)處理柱經(jīng)3 倍柱體積的乙腈活化，再用3 倍柱體積的0.1%（V/V）TFA溶液洗去乙腈。樣品用50%（V/V）TFA溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3后過(guò)柱。經(jīng)3 倍柱體積的0.1%（V/V）TFA液脫鹽后，用1 mL 80%（V/V）乙腈/0.1%（V/V）TFA溶液分3 次洗脫，洗脫液冷凍干燥后于－20 ℃保存，用于質(zhì)譜分析。

1.3.3 反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

將凍干樣品用0.1%（V/V）的甲酸水溶液配制成0.5 μg/μL的溶液，離心，取上清液進(jìn)行反相液相色譜（reversed phase liquid chromatography，RPLC）-MS/ MS分析，進(jìn)樣量為20 μL。色譜分析條件：流動(dòng)相A為0.1%（V/V）的甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%（V/V）的甲酸-乙腈溶液，流速為200 nL/min。梯度洗脫過(guò)程如下：0～2 min，0%～5% B；2～95 min，5%～35% B；95～108 min，35%～80% B；108～120 min，80%～0% B。自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括一根4 cm的自制毛細(xì)管富集柱（200 μm，內(nèi)徑）和一根12 cm的自制毛細(xì)管分析柱（75 μm，內(nèi)徑）。兩根柱子均填充C18AQ填料。

質(zhì)譜分析條件：毛細(xì)管的溫度為200 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV，歸一化碰撞能量為35.0%，一級(jí)掃描范圍400～2 000 D。均使用數(shù)據(jù)依賴(lài)模式對(duì)MS和MS/MS進(jìn)行圖譜采集，掃描模式為全掃描。全掃描中豐度最高的6 個(gè)離子峰進(jìn)行MS/MS掃描，其中動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)為2，重復(fù)容忍時(shí)間為30 s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為90 s。利用Xcalibur軟件進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。每個(gè)樣品重復(fù)兩次，對(duì)兩次結(jié)果中重復(fù)的肽段視為有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

Xcalibur采集的*.RAW文件用Thermo Proteome Discoverer Daemon（v1.4）轉(zhuǎn)換成*.MGF格式，之后用Mascot 2.3.0軟件在牛（bovine，蛋白質(zhì)數(shù)目為17 890）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）中進(jìn)行檢索。搜庫(kù)參數(shù)如下：不設(shè)置酶切、最大漏切數(shù)和固定修飾，可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸的氧化（＋15.994 9 D）。母離子的質(zhì)量容忍偏差為20×10－6，碎片離子為0.8 D。導(dǎo)出肽段時(shí)設(shè)置Score＞20，P＜0.01，同時(shí)控制假陽(yáng)性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜1%。

1.3.5 ACE抑制活性的檢測(cè)

參考Murray等[13]的方法并按本實(shí)驗(yàn)所需條件部分調(diào)整方法。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（100 mmol/L，pH 8.3，含300 mmol/L NaCl）配制一定濃度的抑制劑溶液（樣品）和1.6 mmol/L的FAPGG溶液。20 mg兔肺丙酮粉加入20 倍體積的PBS（100 mmol/L，pH 8.3，含5%丙三醇），4 ℃振搖過(guò)夜。30 000×g、4 ℃離心30 min，上清液保存于4 ℃，臨用前用PBS（100 mmol/L，pH 8.3，含300 mmol/L NaCl）稀釋5 倍，即為實(shí)驗(yàn)所用的ACE溶液。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置樣品組和對(duì)照組。樣品組：85 μL抑制劑溶液與15 μL的ACE溶液混合均勻，加入100 μL FAPGG溶液，立即于340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為A0。37 ℃溫育60 min后再次于340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為A1。測(cè)定各個(gè)樣品的吸光度，令ΔA＝A0－A1。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。對(duì)照組：將抑制劑溶液用緩沖溶液替代，其他步驟同樣品組。

計(jì)算抑制率的公式如下：

式中：I表示抑制率/%；ΔAcontrol表示對(duì)照組0 min與60 min時(shí)吸光度的差值；ΔAsample表示樣品組0 min與60 min時(shí)吸光度的差值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酸乳ACE抑制活性

表 1 4 種酸乳肽樣品ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activities of four yogurt samples

ACE抑制活性是乳源活性肽中比較明確且研究較多的生物活性[14-18]，本研究利用ACE抑制活性作為酸乳活性的檢測(cè)指標(biāo)。表1為4 種酸乳樣品的ACE抑制率，樣品質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg/mL。由數(shù)據(jù)可以看出，4 種酸乳樣品的ACE抑制率均具有劑量依賴(lài)性，每種酸乳在不同質(zhì)量濃度之間的ACE抑制率均具有顯著性差異（P＜0.05）；在3 個(gè)樣品質(zhì)量濃度下，相同質(zhì)量濃度條件下CR24＋K的ACE的抑制率均為最高，且當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL和2.0 mg/mL時(shí)，CR24＋K的ACE的抑制率與其他3 種酸乳相比具有顯著性差異（P＜0.05），因此CR24＋K的ACE抑制能力與其他3 種酸乳相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。綜上所述，4 種酸乳的ACE抑制能力排序?yàn)镃R24＋K＞ST＞YWS＞FW。

2.2 基于LC-MS/MS的酸乳肽譜

酸乳按照1.3節(jié)中方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析，基峰色譜圖如圖1所示，4 種酸乳的基峰譜圖差異較大，CR24＋K的基峰譜與其他3 種相比，出峰時(shí)間較為集中，絕大多數(shù)高豐度的峰出現(xiàn)在20～50 min。所檢測(cè)到的肽的維恩（Venn）圖見(jiàn)圖2，YWS、FW、CR24＋K和ST樣品分別鑒定到152、125、364、274 條肽段，其中有23 條肽段在4 種樣品中均檢測(cè)到，有52、19、213、79 條肽段分別僅在對(duì)應(yīng)樣品中檢測(cè)到。

4 種酸乳樣品中，CR24＋K不僅鑒定到的肽段數(shù)量最多，且獨(dú)有肽的數(shù)量同樣最多，364 條肽段中有213 條肽段在其他3 種酸乳中均未鑒定到，其數(shù)量顯著高于其他3 種酸乳的52、19 條和79條。CR24＋K中獨(dú)有的213 條肽段中，源于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的肽段分別有48、25、69、71 條。其中一些肽已有文獻(xiàn)報(bào)道具有不同生理活性，如源于αs2-酪蛋白的YQKFPQY f（89～95）具有較高的ACE抑制活性[19]；源于β-酪蛋白的PGPIPN f（63～68）具有免疫調(diào)節(jié)活性[20]；源于κ-酪蛋白的YYQQKPVA f（42～49）和LPYPY f（56～60）則分別具有抗菌活性[21]和DPP-IV抑制活性[22]。β-酪啡肽是由β-酪蛋白酶解得到的一類(lèi)阿片活性肽，其中研究最多的β-酪啡肽7（β-casomorphin-7，β-CM7）是來(lái)源于β-酪蛋白60～66 位的一種具有阿片活性的七肽物質(zhì)（YPFPGPI）[23]。β-CM7在牛乳[24]、奶酪[25]等乳制品中均有報(bào)道，但在酸乳中沒(méi)有檢測(cè)出β-CM7[25-26]，本研究的酸乳樣品中也均未檢測(cè)到β-CM7。

酸乳商品信息中標(biāo)注CR24＋K的發(fā)酵菌種為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌，與YWS、FW所用菌種相同，盡管相同菌株投放比例不同也可能會(huì)影響肽的產(chǎn)量，但并非導(dǎo)致肽的數(shù)量及活性差異的主要原因。4 種酸乳的蛋白質(zhì)量濃度不同，但質(zhì)譜分析時(shí)所用樣品蛋白質(zhì)量濃度相同，因此肽的數(shù)量及活性差異也不是由蛋白質(zhì)量濃度所引起。這些表明，酸乳原料組成和配方與肽的數(shù)量及抑制活性可能有直接關(guān)系，酸乳肽譜及活性的研究可為酸乳產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)提供技術(shù)支持。

圖 1 4 種酸乳基峰色譜圖Fig. 1 Base peak chromatograms of four yogurt samples by LC-MS/MS analysis

圖 2 LC-MS/MS鑒定4 種酸乳肽數(shù)目Fig. 2 Venn diagram showing the numbers of peptides identif i ed in four yogurts by LC-MS/MS analysis

2.3 酸乳中ACE抑制肽

4 種酸乳中鑒定到已有文獻(xiàn)報(bào)道的典型的ACE抑制肽，如從YWS中鑒定到的源于αs2-酪蛋白的AMKPWIQPK f（189～197），從CR24＋K和ST中鑒定到的源于β-酪蛋白的LNVPGEIVE f（6～14）、NIPPLTQTPV f（73～82）等肽段均具有較高的ACE抑制活性，半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）分別為600、300、173?μmol/L[27]。由2.1、2.2節(jié)可知CR24＋K ACE抑制活性最高且鑒定到的肽段數(shù)最多。表2列出了CR24＋K獨(dú)有肽段中的ACE抑制肽與潛在的ACE抑制肽。其中4 條肽段與文獻(xiàn)中的肽段序列一致，分別為源于αs1-酪蛋白FPEVFGK f（28～35），源于β-酪蛋白的TPVVVPPFLQP f（80～90）、KVLPVPQ f（169～175）以及源于κ-酪蛋白的LPYPY f（56～60），IC50分別為140、749、1 000、28.9 μmol/L。6 條肽段與文獻(xiàn)中的肽段序列相似且C末端三肽的序列完全一致。由于ACE抑制肽的C末端三肽與其抑制能力關(guān)系緊密[28]，因此可以認(rèn)為這6 條肽段具有潛在的ACE抑制活性。在檢測(cè)到的ACE抑制肽或潛在的ACE抑制肽中，源于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白的ACE抑制肽分別有2、1、1 條，源于β-酪蛋白的有6 條，可見(jiàn)由β-酪蛋白釋放的ACE抑制肽數(shù)量較多。

表 2 CR24＋K 213 條獨(dú)有肽段中的ACE抑制肽或潛在的ACE抑制肽Table 2 ACE inhibitory peptides and potential ACE inhibitory peptides out of 213 unique peptides of Churu24+K fl avor fermented milk

3 結(jié) 論

本研究利用LC-MS/MS對(duì)4 種市售酸乳的肽譜進(jìn)行研究，YWS、FW、CR24＋K和ST共分別鑒定到152、125、364、274 條肽段，其中獨(dú)有的肽段分別有52、19、213、79 條。初乳24＋K風(fēng)味發(fā)酵乳擁有最多的總肽段數(shù)和獨(dú)有的肽段數(shù)。以ACE抑制活性作為酸乳生物活性檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示初乳24＋K風(fēng)味發(fā)酵乳的ACE的抑制活性最高。經(jīng)過(guò)肽譜、ACE抑制活性與原料、菌種的相關(guān)性研究，表明酸乳的原料和組成可能影響其產(chǎn)品的肽數(shù)量和ACE抑制活性。

通過(guò)對(duì)酸乳肽譜和ACE抑制活性的考察，可更好地了解酸乳肽譜及活性的性質(zhì)和特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究酸乳肽的功能和特點(diǎn)以及乳源ACE抑制肽提供了理論依據(jù)。

[1] HERNáNDEZ-LEDESMA B, GARCíA-NEBOT M J, FERNáNDEZTOMé S, et al. Dairy protein hydrolysates: peptides for health benefits[J]. International Dairy Journal, 2014, 38(2): 82-100. DOI:10.1016/j.idairyj.2013.11.004.

[2] RICCI-CABELLO I, HERRERA M O, ARTACHO R. Possible role of milk-derived bioactive peptides in the treatment and prevention of metabolic syndrome[J]. Nutrition Reviews, 2012, 70(4): 241-255. DOI:10.1111/j.1753-4887.2011.00448.

[3] PASIN G, COMERFORD K B. Dairy foods and dairy proteins in the management of type 2 diabetes: a systematic review of the clinical evidence[J]. Advances in Nutrition, 2015, 6(3): 245-259. DOI:10.3945/ an.114.007690.

[4] CHEN M, SUN Q, GIOVANNUCCI E, et al. Dairy consumption and risk of type 2 diabetes: 3 cohorts of US adults and an updated metaanalysis[J]. Bmc Medicine, 2014, 12(4): 1088-1096. DOI:10.1186/ s12916-014-0215-1.

[5] SAAVEDRA L, HEBERT E M, MINAHK C, et al. An overview of“omic” analytical methods applied in bioactive peptide studies[J]. Food Research International, 2013, 54(1): 925-934. DOI:10.1016/ j.foodres.2013.02.034.

[6] FOLTZ M, MEYNEN E E, BIANCO V, et al. Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from a lactotripeptide-enriched milk beverage are absorbed intact into the circulation[J]. The Journal of Nutrition, 2007, 137(4): 953-958.

[7] OTTE J, SHALABY S M, ZAKORA M, et al. Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates: effect of substrate, enzyme and time of hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(5): 488-503. DOI:10.1016/j.idairyj.2006.05.011.

[8] HERNáNDEZ-LEDESMA B, MIRALLES B, AMIGO L, et al. Identif i cation?of?antioxidant?and?ACE-inhibitory?peptides?in?fermented?milk[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(6): 1041-1048. DOI:10.1002/jsfa.2063.

[9] PAN D D, GUO Y X. Optimization of sour milk fermentation for the production of ACE-inhibitory peptides and purification of a novel peptide from whey protein hydrolysate[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(7): 472-479. DOI:10.1016/j.idairyj.2010.01.007.

[10]?STUKNYT??M,?CATTANEO?S,?MASOTTI?F,?et?al.?Occurrence?and fate of ACE-inhibitor peptides in cheeses and in their digestates following in vitro, static gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry, 2015, 168: 27-33. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.045.

[11] 崔磊, 張少輝. 國(guó)內(nèi)6 種市售酸奶中的ACE抑制肽研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2012, 40(6): 30-32. DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2012.06.008.

[12] JIN Y, YU Y, QI Y X, et al. Peptide profiling and the bioactivity character of yogurt in the simulated gastrointestinal digestion[J]. Journal of Proteomics, 2016, 141: 24-46. DOI:10.1016/ j.jprot.2016.04.010.

[13] MURRAY B A, WALSH D J, FITZGERALD R J. Modification of the furanacryloyl-l-phenylalanylglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2004, 59(2): 127-137. DOI:10.1016/j.jbbm.2003.12.009.

[14] CHAVES-LóPEZ C, TOFALO R, SERIO A, et al. Yeasts from Colombian Kumis as source of peptides with Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity in milk[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 159(1): 39-46. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2012.07.028.

[15] GONZALEZ-GONZALEZ C R, TUOHY K M, JAUREGI P. Production of angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity in milk fermented with probiotic strains: effects of calcium, pH and peptides on the ACE-inhibitory activity[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(9): 615-622. DOI:10.1016/j.idairyj.2011.04.001.

[16] OTTE J, LENHARD T, FLAMBARD B, et al. Influence of fermentation temperature and autolysis on ACE-inhibitory activity and peptide?prof i les?of?milk?fermented?by?selected?strains?of?Lactobacillus helveticus and Lactococcus lactis[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(4): 229-238. DOI:10.1016/j.idairyj.2010.12.008.

[17] RASIKA D M D, UEDA T, JAYAKODY L N, et al. ACE-inhibitory activity of milk fermented with Saccharomyces cerevisiae K7 and Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC 12007[J]. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 2015, 43(2): 141-151. DOI:10.4038/jnsfsr.v43i2.7942.

[18] SHAKERIAN M, RAZAVI S H, ZIAI S A, et al. Proteolytic and ACE-inhibitory activities of probiotic yogurt containing non-viable bacteria as affected by different levels of fat, inulin and starter culture[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015, 52(4): 2428-2433. DOI:10.1007/s13197-013-1202-9.

[19] CONTRERAS M D M, CARRóN R, MONTERO M J, et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 19(10): 566-573. DOI:10.1016/ j.idairyj.2009.05.004.

[20] MEISEL H. Overview on milk protein-derived peptides[J]. International Dairy Journal, 1998, 8(Suppl 5/6): 363-373. DOI:10.1016/S0958-6946(98)00059-4.

[21]?LóPEZ-EXPóSITO?I,?MINERVINI?F,?AMIGO?L,?et?al.?Identif i cation?of antibacterial peptides from bovine kappa-casein[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(12): 2992-2997.

[22] NONGONIERMA A B, FITZGERALD R J. Susceptibility of milk protein-derived peptides to dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) hydrolysis[J]. Food Chemistry, 2014, 145(7): 845-852. DOI:10.1016/ j.foodchem.2013.08.097.

[23] NGUYEN D D, JOHNSON S K, BUSETTI F, et al. Formation and degradation of beta-casomorphins in dairy processing[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015, 55(14): 1955-1967. DOI: 10.1080/10408398.2012.740102.

[24] de NONI I, CATTANEO S. Occurrence of β-casomorphins 5 and 7 in commercial dairy products and in their digests following in vitro simulated gastro-intestinal digestion[J]. Food Chemistry, 2010, 119(2): 560-566. DOI:10.1016/j.foodchem.2009.06.058.

[25]?ANNA?C,?EL?BIETA?K,?HENRYK?K,?et?al.?Milk?from?cows?of?different β-casein genotypes as a source of β-casomorphin-7[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2012, 63(4): 426-430. DOI:10.3109/09637486.2011.634785.

[26] SCHIEBER A, BRU?CKNER H. Characterization of oligo- and polypeptides isolated from yoghurt[J]. European Food Research and Technology, 2000, 210(5): 310-313. DOI:10.1007/s002170050555.

[27] van de VEN C. Biochemical and functional characterisation of casein and whey protein hydrolysates. A study on the correlations between biochemical and functional properties using multivariate data analysis[D]. Wageninge: Wageningen Universiteit, 2002: 13.

[28] CUSHMAN D W, ONDETTI M A. Design of angiotensin converting enzyme inhibitors[J]. Nature Medicine, 1999, 5(10): 1110-1112. DOI:10.1038/13423.

[29] JéR?ME T, LAURENT M, JEAN-LUC G. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovine αS2-casein[J]. FEBS Letters, 2002, 531(2): 369-374. DOI:10.1016/ S0014-5793(02)03576-7.

[30] van de VEN C, GRUPPEN H, de BONT D B A, et al. Optimisation of the angiotensin converting enzyme inhibition by whey protein hydrolysates using response surface methodology[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(10): 813-820. DOI:10.1016/S0958-6946(02)00077-8.

[31] MAENO M, YAMAMOTO N, TAKANO T. Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus, CP790[J]. Journal of Dairy Science, 1996, 79(8): 1316-1321. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(96)76487-1.

[32] RICHARD J F, BRIAN A M, DANIEL J W. The emerging role of dairy proteins and bioactive peptides in nutrition and healthhypotensive peptides from milk proteins[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134: 980-988.

[33] ABUBAKAR A, SAITO T, KITAZAWA H, et al. Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion[J]. Journal of Dairy Science, 1998, 81(12): 3131-3138. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(98)75878-3.

[34] MIGUEL M, RECIO I, RAMOS M, et al. Antihypertensive effect of peptides obtained from Enterococcus faecalis-fermented milk in rats[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(9): 3352-3359.

[35] GóMEZ-RUIZ J á, RAMOS M, RECIO I. Identification of novel angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides from ovine milk proteins by CE-MS and chromatographic techniques[J]. Electrophoresis, 2007, 28(22): 4202-4211. DOI:10.1002/ elps.200700324.

Peptide Prof i ling of Yogurts Identif i ed by LC-MS/MS and Their ACE Inhibitory Activities

YU Yang1,2, YU Wenhao1,2, YAN Jiaze2, DONG Hao2, DONG Jiageng3, JIN Yan2,*, QI Yanxia1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical and Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China; 3. Liaoning Huishan Biotechnology Research Co. Ltd., Shenyang 110031, China)

This study investigated the peptide prof i ling of four yogurt samples (Youweishu fl avored fermented milk, plain fl avored fermented milk, Churu 24+K fl avored fermented milk and Shitian fl avored fermented milk) from local market by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A total of 152, 125, 364 and 274 peptides were identif i ed from the yogurts by LC-MS/MS, respectively. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity was used to evaluate the biological activities of yogurt peptides. The ACE inhibition rates of peptides from these yogurts were 46.84%, 42.75%, 77.41% and 63.84% at a concentration of 2.0 mg/L, respectively. The large number of identif i ed peptides and high ACE inhibitory activities in Churu 24+K fl avor fermented milk may be related to its special ingredients. This study may provide the theoretical basis for further study on the functions and ACE inhibitory activity of yogurt peptides.

yogurt; peptide prof i ling; LC-MS/MS; ACE inhibitory activity

10.7506/spkx1002-6630-201705034

TS252.54

A

1002-6630（2017）05-0208-05

于洋, 于文皓, 晏嘉澤, 等. 基于LC-MS/MS的酸乳肽譜及ACE抑制活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 208-212.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705034. http://www.spkx.net.cn

YU Yang, YU Wenhao, YAN Jiaze, et al. Peptide prof i ling of yogurts identif i ed by LC-MS/MS and their ACE inhibitory activities[J]. Food Science, 2017, 38(5): 208-212. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705034. http://www.spkx.net.cn

2016-05-18

遼寧省博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（20141107）

于洋（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：yy361878997@163.com

*通信作者：靳艷（1968—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：yanjin@dicp.ac.cn

祁艷霞（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：qiyanxia@dlou.edu.cn