曹露 周丹 李濤 陳琳琳 譚曉秋 劉力 劉雪茹△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科； 2.醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室·西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川 瀘州 646000)

論 著

右美托咪定對乳大鼠心肌細(xì)胞線粒體活性氧和細(xì)胞凋亡的影響*

曹露1周丹1李濤2陳琳琳2譚曉秋2劉力1劉雪茹1△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科； 2.醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室·西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川 瀘州 646000)

目的：探討右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)對線粒體介導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激通路的作用。方法：取新生乳大鼠(3～4天)的心肌進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后分為對照組(C組)、H2O2組(終濃度500 μM，H組)、右美托咪定組(5 μM DEX，D組)、聯(lián)合用藥組(500 μM H2O2+5 μM DEX，DH組)。各組細(xì)胞分別給予相應(yīng)藥物刺激6 h，采用流式細(xì)胞儀測定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平及心肌細(xì)胞凋亡變化；并通過ELISA法測定各組乳大鼠心肌細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡因子Caspase-3，Caspase-9表達(dá)的變化。結(jié)果：與H2O2組相比，DEX明顯抑制H2O2介導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞的ROS水平增加(P<0.05)；下調(diào)線粒體介導(dǎo)的下游凋亡因子Caspase-3, Caspase-9的表達(dá)(P<0.05)，從而減少H2O2誘導(dǎo)的凋亡(P<0.05)。結(jié)論：右美托咪定通過抑制心肌細(xì)胞活性氧水平以及下調(diào)線粒體介導(dǎo)的Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)發(fā)揮抑制凋亡作用，對心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

右美托咪定；心肌細(xì)胞；活性氧；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一種新型的高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，目前廣泛應(yīng)用于ICU和手術(shù)過程中[1,2]?？赏ㄟ^抑制交感神經(jīng)興奮性和增強(qiáng)迷走神經(jīng)興奮性，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗驚厥、抗寒顫、催眠遺忘、穩(wěn)定血流動力學(xué)、減少插管時應(yīng)激反應(yīng)、減少麻醉劑與阿片類藥物的用量和改善麻醉恢復(fù)等一系列作用[3]。右美托咪定對機(jī)體許多重要臟器如心臟、大腦、腎臟、肝、肺、胃腸道等具有保護(hù)作用[4,5]。有研究報道提示，DEX減少心肌I/R損傷可能與調(diào)控心肌線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transition pore, mPTP)開放及其上游線粒體ATP敏感性鉀通道(Mitochondrial ATP sensitive potassium channels, mitoKATP)活性有關(guān)[6]。由于線粒體氧化應(yīng)激在心肌損傷與保護(hù)中發(fā)揮重要作用，而活性氧(Rreactive oxygen species，ROS)在一定程度上能夠反應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激程度。本文擬探討右美托咪定對線粒體介導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激通路的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

新生SD大鼠3～4天(由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)；右美托咪定(江蘇恩華)；H2O2(Sigma，美國)；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco，美國)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美國)；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Rhodamine Phalloidin)(Cytoskeleton，美國)；DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)、活性氧檢測試劑盒、Caspase-3和Caspase-9試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

首先將新生乳鼠心臟在無菌條件下取出，經(jīng)PBS液反復(fù)沖洗后，剪去心房和結(jié)締組織，然后再用PBS液沖洗，剪成1 mm3碎塊，再加入0.25%胰蛋白酶置于4℃冰箱過夜，Ⅱ型膠原酶洗滌2次，直到心臟組織基本消化完畢，1500 g·min-1離心5min后去除上清液，再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將沉淀充分吹打混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中通過差速貼壁，以去除心臟的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，再次的心肌細(xì)胞懸液取8 ml接種到4個3.5 cm的培養(yǎng)皿中并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后分組處理。

1.3 實驗分組

實驗分為四組：對照組(C組)、H2O2組(H組)、右美托咪定組(D組)、右美托咪定+H2O2組(DH組)。首先對D組和DH組加入終濃度為0.5 μM的右美托咪定，隨后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱12 h孵育。待孵育結(jié)束后，在H組和DH組中加入500 μM的H2O2進(jìn)行孵育。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧自由基(ROS)水平變化

由于乳鼠心肌細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，采用原位裝載探針檢測ROS的方法。使用1:1000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μM。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。各組心肌細(xì)胞于37℃下避光孵育0.5 h，再用PBS洗兩次，然后用流式細(xì)胞儀檢測。同時設(shè)置陽性對照(Rosup)，通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30 min后可以顯著提高活性氧水平。

1.5 ELISA法檢測Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)

Caspase-3，Caspase-9檢測方法按照試劑盒(江蘇碧云天公司)說明書進(jìn)行，主要包括測定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品收集、酶活性的檢測等實驗步驟。以對照組(未經(jīng)DEX和H2O2處理)的pNA的量為1，對其他三組的pNA的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而比較各組Caspase-3，Caspase-9的活性。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實驗

采用FITC標(biāo)記α-肌動蛋白觀察培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的形態(tài)。將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞鋪在玻片上生長，48 h后取出，PBS清洗三遍后分別用4%的多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%的Triton X-100處理20 min，5%的BSA室溫封閉1 h，之后使用小鼠抗α-肌動蛋白一抗4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠二抗孵育1 h，最后使用DAPI室溫孵育10 min后進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)過上述處理之后，使用胰酶消化為單個的心肌細(xì)胞，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色后使用流式細(xì)胞儀(BD公司)進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)

使用FITC標(biāo)記α-肌動蛋白觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞呈梭形，橫紋和肌動蛋白清晰。

圖1 乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)(600X)藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核；綠色：FITC標(biāo)記的α-actin。

2.2 DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS的影響

與對照組相比，陽性處理組(Rosup)的ROS水平明顯增加(P<0.01)。500 μM H2O2處理6 h后，ROS水平也明顯增加(P<0.05)。聯(lián)合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，與單純使用H2O2組相比，ROS水平明顯下降(P<0.05)。而單獨使用5 μM DEX，ROS水平的下降并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS的影響(n=5)注：與Control相比，*P<0.05；與500 μM H2O2組相比，#P<0.05。

2.3 DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響

與對照組相比，500 μM H2O2處理6 h后，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)明顯增加(P<0.01)。聯(lián)合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，與單純使用H2O2組相比，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與對照組相比，聯(lián)合使用的H2O2和DEX的Caspase-3和Caspase-9表達(dá)依然有所增加(P<0.05)。而單獨使用5 μM DEX，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平有所降低，但并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Caspase-3、-9活性的影響(n=4)注：與Control相比，*P<0.05，**P<0.05；與500 μM H2O2組相比，#P<0.05。

2.4 DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

從圖4中可以看出，對照組細(xì)胞僅有19.9%的細(xì)胞凋亡率(第一象限和第四象限之和)，而使用H2O2處理之后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，由19.9%增加到65.7%(其中早期凋亡占46.2%，晚期凋亡占19.5%)。在使用H2O2的同時加入右美托咪定，可以明顯降低細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率為38.0%(其中早期凋亡占24.9%，晚期凋亡占13.1%)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測DEX對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響注：Negative為沒有使用凋亡檢測試劑的陰性對照，用于細(xì)胞形態(tài)和熒光校正與調(diào)零。

3 討論

右美托咪定(DEX)因具有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛，抗交感而無呼吸抑制的臨床特點而在臨床上廣泛使用。有研究表明DEX還具有心肌保護(hù)作用，包括能夠降低心輸出量、前后負(fù)荷，減慢心率，降低心肌耗氧量，增加心內(nèi)膜的血液供應(yīng)，使心肌氧供需趨于平衡[7]。但是也有研究提示右美托咪定不但對血流動力學(xué)和冠狀動脈血流量沒有影響，反而增加心肌梗塞面積[8]。表明右美托咪定對心肌保護(hù)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

線粒體是真核動物細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，被稱為細(xì)胞的“動力工廠”。線粒體生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的過程中伴隨著活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[9]。ROS是參與維持細(xì)胞正常生理功能[10]，以及組織修復(fù)等活動，而當(dāng)ROS將過度生成，超過了抗氧化的能力，增加了心肌氧化的應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而對線粒體的功能和能量的產(chǎn)生造成了不可逆的損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[11]。因此可知線粒體氧化應(yīng)激將導(dǎo)致線粒體能量代謝失調(diào)，從而進(jìn)一步損傷了線粒體[12]。心肌細(xì)胞的凋亡是心肌損傷的重要機(jī)制，而線粒體凋亡途徑在心肌細(xì)胞的凋亡起著非常重要的作用[13]。Caspase-3、Caspase-9活性和表達(dá)增加被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑發(fā)生的標(biāo)志[14]。有關(guān)通路在DEX心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用的研究未見系統(tǒng)的報道。

過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型是常用于研究心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的手段之一，本實驗研究了DEX對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷后ROS和細(xì)胞凋亡的影響。實驗結(jié)果表明，H2O2明顯增加心肌細(xì)胞ROS水平，使線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-9表達(dá)增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。而DEX能夠一定程度逆轉(zhuǎn)了H2O2導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果表明DEX能夠作用于心肌細(xì)胞的線粒體凋亡通路，抑制H2O2對心肌細(xì)胞的損傷，降低了心肌細(xì)胞凋亡。實驗結(jié)果表明,單給DEX組的ROS產(chǎn)生與正常組相比不存在差異，這說DEX并未對基礎(chǔ)水平的ROS產(chǎn)生影響。而H2O2則會引起心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)量增加，造成過量的ROS得不到有效的清除。因此過量的ROS能夠造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，引起線粒體凋亡通路活化，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而DEX能夠緩解治療組心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激負(fù)荷，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，減少Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)活性。

綜上所述，DEX能夠抑制心肌細(xì)胞的線粒體凋亡途徑，達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，但是其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

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Effects of dexmedetomidine on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells*

Cao Lu1, Zhou Dan1, Li Tao2, Chen Lin-lin1, Tan Xiao-qiu1, Liu Li1, Liu Xue-ru1△

(1.Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University; 2. Key Lab of Medical Electrophysiology, Ministry of Education; Institute of Cardiovascular Medicine, Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate the effects of dexmedetomidine (DEX) on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells. Methods: Neonatal rats (3-4 days) cardiomyocytes (NRCMs) were cultured for 24 h and divided into four groups: control group (Group C), H2O2group (final concentration of 500 μM, Group H), dexmedetomidine group (5 μM DEX, group D), and H2O2+DEX group (500 μM H2O2+ 5 μM DEX, group DH). Flow cytometry (FCM) was used to measure the effect of DEX on the ROS level and apoptosis of myocardial cells in rats. The level of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by ELISA. Results: DEX significantly inhibited the increase of ROS levels in NRCMs induced by H2O2(P<0.05). The increased level of Caspase-3, Caspase-9 induced by H2O2was significantly inhibited by DEX (P<0.01 or P<0.05). DEX significantly attenuated cells ratio of apoptosis induced by H2O2(P<0.05). Conclusion: Dexmedetomidine inhibited the ROS levels and the activity of mitochondria mediated Caspase-3 and Caspase-9 expression and attenuated H2O2-induced apoptosis in myocardial cells, which may involved in the myocardial protective effect of DEX.

Dexmedetomidine; Myocardial cells; ROS; Oxidative stress; Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81401632)；西南醫(yī)科大學(xué)青年基金項目(編號：2014QN-003)

曹露，女，碩士研究生在讀，主要從事臨床麻醉學(xué)研究，Email：85933718@qq.com。

△通訊作者：劉雪茹，女，講師，主要從事臨床麻醉學(xué)研究，Email：liuxueru1981@163.com。

2016-11-28)