竇鵬揮，胡春榮，馬利峰，邢宇彤，朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

PTEN和缺氧誘導因子- 1α在食管鱗癌組織中的表達①

竇鵬揮，胡春榮，馬利峰，邢宇彤，朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討PTEN和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)在食管鱗癌組織中的表達及臨床意義。方法:使用免疫組化和RT-PCR的方法對PTEN，HIF-1α在食管癌組織中的表達情況進行定量，并研究其相關性。結果:PTEN和HIF-1α多被發(fā)現位于食管鱗癌細胞的細胞質、血管細胞質以及內皮細胞中;PTEN在T0組(0.1928±0.0164)、一期組(0.1608±0.099)、二期組(0.1423±0.073)及三期組(0.1272±0.096)患者中的表達逐步降低，差異顯著(P<0.01)，HIF-1α表達在T0(0.1320±0.0108)、一期組(0.1667±0.0089)、二期組(0.1985±0.0128)及三期(0.2483±0.0165)患者逐步增高，差異顯著(P<0.01)，PTEN和HIF-1α表達量之間的差異顯著(P<0.01) 。結論：在所有食管鱗癌病例組織中，PTEN與HIF-1α基因的表達與腫瘤的分期相關性顯著，說明這兩種蛋白的表達情況可能對食管鱗狀細胞癌的治療效果及預后有重要的影響。 在基因靶向治療、抗癌新藥研發(fā)等方面，提供新的選擇方向和理論基礎。

食管鱗癌；PTEN；HIF-1α

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，雖然其發(fā)生機制尚不明確，但已知其受很多相關因素的調控。主要發(fā)生在食管黏膜上皮，臨床類型中鱗癌系比較常見的[1]。盡管近些年食管癌的療效已經不斷改善，但其預后仍然較差，患者的死亡率也較高，患者的5年生存率低于 17%[2]。在食管鱗癌中，PTEN和HIF- 1α的表達情況以及相關性的研究較少。在本研究中，通過免疫組織化學和RT-PCR研究了食管鱗狀細胞癌中PTEN和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達及相關性， 探討其與食管癌發(fā)生發(fā)展機制的關系，為食管癌的靶基因治療、預后等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

43例食管鱗癌患者組織標本，均來自我院胸外科2010-10～2013-10經治的病人(所有患者術前均未接受放化療)，年齡39～70歲，平均(51.67±9.91)歲;其中6例Tis(原位癌)，13例T1期，10例T2期，9例T3期，5例T4期。15例T0期作為正常對照組， 根據TNM臨床分期隨機將其分成四組(正常對照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)， 四組患者在年齡、 性別、 病變長度等情況無明顯差別(P>0. 05) 。S-P試劑(Maixin，中國)，抗體系兔多克隆VEGF抗體(abcam，美國)。

1.2 方法

(1)免疫組化SP法步驟：切片逐步脫蠟至水，進行抗原修復，PBS緩沖液洗3min/3次。滴加UltraVBlock，室溫孵育5min。緩沖液洗3min/3次。滴加一抗，于37℃孵育2h。PBS緩沖液沖洗5min/2次。滴加增強子，室溫孵育15min。PBS緩沖液沖洗5min/2 次。然后滴加HRPPolymer(酶標二抗工作液) ， 室溫下孵育 20min。PBS緩沖液沖洗 5min/2 次。將DABPlusSubstrate底物滴加到切片上， 孵育10min。蒸餾水洗滌，蘇木素復染、常規(guī)脫水、透明、封片、拍照。

(2)RT-PCR操作步驟：用RT-PCR檢測PTEN、HIF-1α基因的表達:從每個實驗材料中提取總RNA。同時，根據上述兩個基因設計PCR引物，通過RT-PCR試劑盒檢測每個樣品中每個基因的轉錄表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS14.0軟件比較各組之間的樣本平均值，使用獨立樣本t檢驗和方差分析ANOVA分析。

2 結果

2.1 食管鱗癌病人組織內PTEN和HIF-1α表達的特點

由棕色顆粒來顯示PTENmRNA和HIF-1αmRNA表達水平， 大多位于內皮細胞、血管細胞質和腫瘤細胞的細胞質中，測量食管鱗狀細胞癌中PTENmRNA和HIF-1αmRNA的表達，隨著病理分期的不同，表達量亦差異性顯著，PTEN在T0組(0.1928±0.0164)、一期組(0.1608±0.099) 、 二期組(0.1423±0.073) 及三期組(0.1272±0.096)患者中的表達逐步降低，差異顯著(P<0. 01) ，HIF- 1α表達在T0(0.1320±0.0108)、一期組(0.1667±0.0089) 、 二期組(0.1985±0.0128)及三期(0.2483±0.0165)患者逐步增高，差異顯著(P<0.01)。見圖1， 圖2。

2.2PTEN，HIF-1α和食管鱗狀細胞癌相關性研究的PTEN的表達與HIF-1α的表達顯著相關(r=-0. 36，-0. 68，均P<0.05) 。

表1 四組患者PTEN/HIF-1α表達情況對比

圖1 食管鱗癌及正常組織中PTEN、HIF-1α表達(S-P法，×400)

圖2 食管鱗癌患者組織內 PTEN、HIF-1α表達量(RT-PCR)

3 討論

PTEN蛋白是第一個被發(fā)現的具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，通過其磷酸化作用，去磷酸化某些蛋白激酶或磷脂，使細胞周期的進展受到抑制，介導細胞凋亡，而且調控細胞黏附、遷移、增殖和分化[3]。PTEN發(fā)揮抑癌作用的途徑包括：PI3K途徑、MAPK途徑和FAK途徑。PTEN基因在多種腫瘤組織中表達缺失，已經被許多研究證實， 如非小細胞肺癌、 乳腺癌、大腸癌、 卵巢癌、 子宮內膜癌、 星形細胞瘤[4～7 ]。 張偉峰等[8]研究表明性別、年齡、腫瘤大小對于PTEN的表達無相關性，但是與腫瘤的分化程度呈正相關；還發(fā)現腫瘤的臨床分期、浸潤深度以及淋巴結轉移與PTEN的表達呈負相關。HIF是細胞適應缺氧環(huán)境因子的主要調節(jié)劑。 缺氧是腫瘤微環(huán)境的特征。調控細胞耐受缺氧環(huán)境的調控因子對于腫瘤細胞的生長必不可少，并且促進腫瘤細胞的生長和轉移。已證實，在多種細胞中廣泛存在HIF-1，激活后直接或間接作用于多種下游基因，參與在缺氧環(huán)境下細胞的生存、 增殖、 凋亡及多種代謝，促進新生血管的形成，并且與腫瘤耐藥等關系密切。在腫瘤組織中，PTEN基因的

缺失促進了癌基因的高表達， 從而加速腫瘤組織生長；HIF-1α可防止腫瘤細胞在生長過程中的凋亡，HIF-1α的高表達使腫瘤細胞耐缺氧的能力得到增強，因此腫瘤細胞可以繼續(xù)的分化、 增殖，危害人體健康，PTEN的低表達與HIF-1α的高表達共同促進了腫瘤的生長、 轉移。HIF-1α的表達和活性受到PTEN調控，通過抑制PI3K-AKT-FARP途徑阻斷HIF-1α蛋白的表達和轉錄活性。當PTEN基因發(fā)生突變或缺失，HIF-1α蛋白的表達和轉錄活性受到影響。前列腺癌的血管生成，是由于PTEN功能喪失，誘導表達HIF一1alpha相關; 導入野生型PTEN的前列腺癌細胞株PC3， 不僅HIF-1α蛋白的表達被明顯抑制，而且VEGF的活性也被抑制，從而使血管形成也受到抑制[9 ]。

在本次研究中證實，在所有食管鱗癌病例組織中，PTEN與HIF-1α基因的表達與腫瘤的分期相關性顯著，說明這兩種蛋白的表達情況可能對食管鱗狀細胞癌的治療效果及預后有重要的影響。在基因靶向治療、抗癌新藥研發(fā)等方面，提供新的選擇方向和理論基礎。

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佳木斯大學面上項目，編號：S2011-036。

竇鵬揮(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。

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1008-0104(2017)01-0067-02

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