聶 磊，畢艷旭，苗小風(fēng)，王 影，王海燕

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦對(duì)難治性癲癇大鼠海馬組織中Slit2表達(dá)的影響①

聶 磊，畢艷旭，苗小風(fēng)，王 影，王海燕

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察左乙拉西坦對(duì)難治性癲癇大鼠海馬組織中Slit2表達(dá)的影響。方法：Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組(IE組)，治療組(LEV治療組)，LEV對(duì)照組(LEV組)。腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品建立難治性癲癇大鼠模型，造模成功后LEV組和LEV治療組給予LEV200mg/(kg·d)灌胃，對(duì)照組和IE組給予等量生理鹽水，應(yīng)用免疫組化法在第1周、2周和4周檢測(cè)各組海馬組織中Slit2的表達(dá)量。結(jié)果：LEV組和對(duì)照組比較，Slit2的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IE組Slit2表達(dá)量明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEV治療組與IE組比較，Slit2表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：Slit2的表達(dá)變化促進(jìn)海馬發(fā)生苔蘚纖維化(MFS)參與難治性癲癇形成，LEV控制癲癇發(fā)生，可能與上調(diào)Slit2的表達(dá)有關(guān)。

難治性癲癇；左乙拉西坦；Slit2；大鼠

癲癇是由大腦神經(jīng)元反復(fù)發(fā)作的異常放電引起的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，約20%～30%患兒發(fā)作不能得到有效控制，稱(chēng)為難治性癲癇(refractoryepilepsy,RE)。兒童RE診斷標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)于已正確診斷的癲癇患兒，應(yīng)用正規(guī)抗癲癇藥物(2種以上)合理治療6個(gè)月到1年后，發(fā)作仍未能減少50%者為兒童RE[1]。在RE的發(fā)病機(jī)制中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重組是其病理特征，海馬苔蘚纖維發(fā)芽(mossyfibersprouting，MFS)被認(rèn)為是其發(fā)生、發(fā)展以及耐藥的關(guān)鍵之一，其促使大腦形成異常興奮性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子Slits家族之一Slit2目前研究最為廣泛，主要在神經(jīng)元中表達(dá)，而在癲癇患者中，其在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均表達(dá)，研究證實(shí)其與MFS的發(fā)生密切相關(guān)[2]。RE的治療仍然以口服藥物為主，左乙拉西坦(levetiracetam,LEV)作為抗癲癇新藥，已經(jīng)獲得了臨床的認(rèn)可，取得了較好的臨床療效，尤其在RE的治療中起了巨大的作用[3,4]，但其具體的抗癲癇機(jī)制是尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立氯化鋰-匹羅卡品(lithium-pilocarpine，Li-pilo)點(diǎn)燃的RE大鼠模型，觀察LEV在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Slit2表達(dá)的影響，探討LEV可能的抗癲癇機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK2013001)110只，清潔級(jí)，體重約180～220g，稱(chēng)體重編號(hào)后隨機(jī)分成對(duì)照組24只、模型組(IE組)31只、治療組(LEV治療組)31只和LEV對(duì)照組(LEV組)24只。

1.2 動(dòng)物造模

IE組和LEV治療組先給與氯化鋰(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)135mg/kg腹腔注射，24h后給與阿托品1mg/kg腹腔注射，20min后再腹腔注射匹羅卡品(美國(guó)Sigma公司)50mg/kg,然后觀察大鼠的行為。按照Racine癲癇行為分級(jí)[5]：0級(jí):無(wú)反應(yīng)或抽搐停止；I級(jí):嘴和面部出現(xiàn)節(jié)律性抽動(dòng)；Ⅱ級(jí):嘴和面部出現(xiàn)節(jié)律性抽動(dòng),同時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí):在Ⅱ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢抽動(dòng)；Ⅳ級(jí):出現(xiàn)后肢站立；Ⅴ級(jí):全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴不自主跌倒。達(dá)到Ⅳ級(jí)及以上即視為造模成功，若發(fā)作程度達(dá)不到等級(jí)，于30min后再次給予未達(dá)等級(jí)大鼠注射匹羅卡品20mg/kg,直至達(dá)到發(fā)作等級(jí)。

1.3 灌胃給藥

將LEV片劑(UCBPharmaS.A.比利時(shí))碾碎并溶解于生理鹽水中，給與LEV治療組和LEV組LEV(200mg/kg·d)灌胃，同時(shí)給予對(duì)照組和IE組等量的生理鹽水。

1.4 標(biāo)本處理

于造模成功后各時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)抽取8只大鼠，10%水合氯醛麻醉，先后用生理鹽水100～200mL和4%的多聚甲醛200mL經(jīng)左心室灌注，待大鼠肝臟變白及四肢抽動(dòng)后斷頭取腦，將腦組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定。

1.5 免疫組織化學(xué)方法

把經(jīng)過(guò)固定和包埋的固態(tài)大鼠腦組織置于石蠟切片機(jī)上，切成約厚度為4μm的切片進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡鏡下(×100)觀察每張切片海馬區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算Slit2的陽(yáng)性

細(xì)胞數(shù)，算得平均值后記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型制作結(jié)果

腹腔注射Li-pilo約20～40min后，大鼠開(kāi)始出現(xiàn)癲癇發(fā)作，持續(xù)抽搐30min以上腹腔注射10%水合氯醛5mL/kg止痙，降低死亡率，實(shí)驗(yàn)中5只大鼠死亡，2只未出現(xiàn)抽搐，3只未達(dá)發(fā)作等級(jí)，均予以剔除。

2.2 海馬組織Slit2表達(dá)量

Slit2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：LEV組和對(duì)照組比較，Slit2的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IE組Slit2表達(dá)量明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEV治療組與IE組比較，Slit2表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠海馬區(qū)Slit2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野

注：a與對(duì)照組相比:P>0.05；b與對(duì)照組相比：P<0.05；c與對(duì)照組相比：P<0.05；d與IE組相比，P<0.05。

3 討論

癲癇是兒童時(shí)期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，兒童是一個(gè)不斷發(fā)育和成熟的過(guò)程，RE對(duì)其身心健康造成嚴(yán)重影響，若發(fā)展為難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)(refractorystatusepilepticus,RSE)，其死亡率達(dá)16%～39%[6]，無(wú)論對(duì)患兒本人、家庭還是社會(huì)都會(huì)造成嚴(yán)重的后果。Slits家族在神經(jīng)軸突導(dǎo)向、神經(jīng)細(xì)胞遷移、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)分化等多種生命活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用，其功能主要通過(guò)LRR-2(leucine-richrepeat2)結(jié)構(gòu)域與Robos結(jié)構(gòu)域結(jié)合實(shí)現(xiàn)。在雙側(cè)對(duì)稱(chēng)的生物，中線是發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的重要中介部位，是動(dòng)物傳遞左右兩側(cè)信息以及協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和整合感覺(jué)輸入的基礎(chǔ)，大多數(shù)的軸突投射到對(duì)側(cè)前要越過(guò)中線，然而這些軸突并不是毫無(wú)秩序、混亂或者反復(fù)穿越中線，中線穿越的過(guò)程離不開(kāi)Slits的精細(xì)調(diào)控[7]。Slit基因敲除后，許多軸突連接不能離開(kāi)中線，甚至有些軸突連接反復(fù)跨越中線[2]。在對(duì)小鼠視網(wǎng)膜軸突發(fā)育的研究實(shí)驗(yàn)、雞和小鼠胚胎腦干縱向軸突發(fā)育實(shí)驗(yàn)以及人類(lèi)胚胎干細(xì)胞多巴胺能神經(jīng)軸突培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Slits對(duì)神經(jīng)元軸突有排斥作用，Slits作為排斥性因子，保證了神經(jīng)元軸突只跨越中線一次，準(zhǔn)確無(wú)誤到達(dá)既定位置，阻止軸突反復(fù)跨越中線形成異常的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。Fang[2]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在RE動(dòng)物模型中1天～2周，Slit2的表達(dá)持續(xù)減低，認(rèn)為這不是癲癇發(fā)生的原因，而是對(duì)神經(jīng)元癇性放電的一種適應(yīng)性變化，同時(shí)也提示下調(diào)Slit2后可能會(huì)促進(jìn)MFS，干擾神經(jīng)的正常連接，在RE的發(fā)病機(jī)制中有所參與。

LEV作為新型抗癲癇藥，具有大腦保護(hù)作用[8]，同時(shí)又其他抗癲癇藥物不具有的優(yōu)點(diǎn)，比如；生物利用度高、線性藥動(dòng)力學(xué)曲線、血漿蛋白結(jié)合率低、無(wú)肝酶誘導(dǎo)作用等，總之具有較高的安全性。大量的國(guó)內(nèi)外臨床研究證實(shí)，左乙拉西坦在難治性癲癇的治療中效果顯著[9，10]，而關(guān)于其具體的抗癲癇機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)LEV治療組與模型組相比，Slit2的表達(dá)升高，結(jié)合Slit2與MFS密切相關(guān)的功能，因此，推測(cè)LEV可能通過(guò)增加Slit2的表達(dá)，阻止甚至逆轉(zhuǎn)大腦海馬組織發(fā)生苔蘚纖維化，一定程度上減輕異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，降低癲癇發(fā)作的敏感性，控制難治性癲癇的發(fā)作。

[1]顧碩，王治平，鮑南,等.多學(xué)科協(xié)作模式診斷和治療兒童藥物難治性癲癇研究[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2014，29(12)：909-912

[2]FangM,LiuGW,PanYM,etal.AbnormalexpressionandspatiotemporalchangeofSlit2inneuronsandastrocytesintemporallobeepilepticfoci:Astudyofepilepticpatientsandexperimentalanimals[J].BrainRes，2010, 1324:14-23

[3]LeeYJ，KangHC，KimHD，etal.Efficacyandsafetyofadjunctivelevetiracetamtherapyinpediatricintractableepilepsy[J].PediatrNeurol，2010，42(2):86-92

[4]SheinbergR,HeymanE,DaganZ.CorrelationBetweenEfficacyofLevetiracetamandSerumLevelsAmongChildrenWithRefractoryEpilepsy[J].PediatrNeurol,2015,52(6)：624-628

[5]RacineRJ.Modificationofseizureactivitybyelectricalstimulation.Motorseizure[J].EletroencephalogrClinⅡNeurophysiol,1972,32(3):281-294

[6]SinghalA,TripathiM.Refractorystatusepilepticus[J].NeurologyAsia, 2013, 18: 67-71

[7]于奇，周啟升，趙曉,等.神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Slit的功能及其分子作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].生理學(xué)報(bào)，2012，64(2):220-230

[8]裴艷瑩，鄒艷紅，王海燕,等.左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中CAMKⅡ及NCX3 表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015，38(4)：26-28

[9]GrossoS,FranzoniE,CoppolaG,etal.Efficacyandsafetyoflevetiracetam:anadd-ontrialinchildrenwithrefractoryepilepsy[J].Seizure,2005,14(14):248-253

[10]舒志剛,衛(wèi)國(guó). 左乙拉西坦治療低齡難治性癲癇患兒臨床研究[J]. 中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2014,17(2)：4-6

The effect of levetiracetam on the expression of Slit2 in hippocampus of rats with refractory epilepsy

NIELei,BIYan-xu,MIAOXiao-feng,WANGYing,WANGHai-yan

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To observe the effect of levetiracetam (LEV) on Slit2 in hippocampus of rats with fractory epilepsy. Methods: Wistar rats were randomly divided into control group, model group (IE group), treatment group (LEV treatment group), and LEV control group (LEV group). Refractory epilepsy rat modes were induced by intraperitoneal injection of lithium-pilocarpine; LEV group and LEV treatment group were given levetiracetam(200mg/kg per a day) by filling the stomach after the mode was established successfully; the control group and IE group were given the same dose of saline solution. The expression of Slit2 in rat hippocampal's tissues were detected respectively at the 1st week, 2nd week and 4th week by immunohistochemical method. Results: There was no significant difference between LEV group and control group(P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionofSlit2ofIEgroupdecreasedsignificantly(P<0.05).ComparedwithIEgroup,theexpressionofSlit2ofLEVtreatmentgroupincreasedsignificantly(P<0.05). Conclusion: The expression of Slit2 promotes rat hippocampal mossy fiber sprouting(MFS) involving in the formation of refractory epilepsy. Levetiracetam is correlated with raising expression of Slit2 and reducing MFS when it controls the incidence of seizures during curing the refractory epilepsy.

refractory epilepsy; levetiracetam; Slit2; rat

佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：13Z1201542。

聶磊(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

王海燕(1957～)女,黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫(yī)師,教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：yhw1957@126.com。

R

B

1008-0104(2017)01-0050-03

2015-11-10)