孫佳斌，李曉光，逄德志，張金波，謝偉裕，鄭佳音，王茉琳

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

TLR4在原發(fā)性高尿酸血癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)①

孫佳斌，李曉光，逄德志，張金波，謝偉裕，鄭佳音，王茉琳

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討TLR4信號(hào)通路在原發(fā)性高尿酸血癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法：利用Western-blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組受試對(duì)象血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達(dá)情況。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平，血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：原發(fā)性高尿酸血癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4信號(hào)及相關(guān)致炎和抗炎因子表達(dá)異常，TLR4可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與原發(fā)性高尿酸血癥患者病程的發(fā)生與發(fā)展。

TLR4；高尿酸血癥；炎癥

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是指在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日兩次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即稱為高尿酸血癥[1]。研究表明HUA與心腦血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病和慢性腎臟疾病等密切相關(guān)，是這些疾病發(fā)生和發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。有報(bào)道顯示在無(wú)癥狀高尿酸血癥患者中存在微炎癥狀態(tài)[3]，Toll受體活化后會(huì)募集MyD88 (myeloiddifferentiationfactor-88)，進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子-KB(Nuclearfactor-kappaB,NF-kB)，活化的NF-KB啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)Toll樣受體的表達(dá)水平，核蛋白NF-κBp65、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的含量，血漿尿酸濃度，分析Toll樣受體與痛風(fēng)炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015-06～2016-05在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診及體檢人群50例，其中健康對(duì)照(HC)20例，男18例，女2例，年齡(45.25±5.37)歲，原發(fā)性高尿酸血癥(HUA)30例，男27例，女3例，年齡(47.58±5.82)歲，入選者需符合原發(fā)性高尿酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、痛風(fēng)、腫瘤、急性感染性疾病及自身免疫病。各組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器

TLR4、NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruze公司，人IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锕荆浑娪緝x(天能公司)，酶標(biāo)儀(Gene公司)，低溫高速離心機(jī)(Beckman公司)。

1.3 樣本采集

抽取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組受試者靜脈血5mL，2000r/min離心10min取血漿，剩余的血細(xì)胞用PBS稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液上層，2000r/min離心10min，吸取懸浮在中層的單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗3次，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白提取及Western-blotting檢測(cè)

常規(guī)方法提取腦組織蛋白，BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。上樣，濃縮膠80V，分離膠120V恒壓電泳，恒流200mA電流，轉(zhuǎn)膜1h。牛奶封閉1h，一抗4℃過(guò)夜，二抗孵育，ECL顯影。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定血漿細(xì)胞因子

按說(shuō)明書(shū)操作，配制標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋血清樣本，上樣、孵育、洗板等，讀取吸光值，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清樣本濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血尿酸水平的比較

HC組受試者尿酸值為312.28±81.35，HUA組受試者尿酸值為533.11±72.91，HUA組血尿酸水平顯著高于HC組(P<0.05)。

2.2NLRP3炎性體蛋白表達(dá)情況

隨著尿酸水平的升高，實(shí)驗(yàn)組TLR4、NF-κB的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

2.3 血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 Western檢測(cè)各組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況

表1 各組TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)情況

表2 血漿IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的表達(dá)

3 討論

TLR4做為固有免疫的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別多種微生物及代謝物的激活信號(hào)如胰島淀粉樣多肽、膽固醇晶體、尿酸鹽晶體等[5]，有報(bào)道顯示可溶性尿酸鹽較MUS更易刺激TLR4和IL-1β的表達(dá)。因此我們假設(shè)TLR4作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)器，可能參與高尿酸血癥患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。本研究顯示原發(fā)性高尿酸血癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、NF-κB的表達(dá)水平高于對(duì)照組，表明TLR4介導(dǎo)的炎癥反啟動(dòng)了高尿酸血癥患體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，同時(shí)參與了病程的進(jìn)展。TLR4被激活后可以進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)的誘發(fā)因子IL-1β和IL-8，進(jìn)一步放大機(jī)體的炎癥反應(yīng)，IL-1β是促進(jìn)多種代謝性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要炎癥因子,IL-8作為一種趨化因子，能激活中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞，使大量中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，因此，IL-8既是免疫反應(yīng)的啟動(dòng)因子，又是持續(xù)炎癥反應(yīng)的誘發(fā)因子。本研究顯示原發(fā)性高尿酸血癥患者血漿中IL-1β和IL-8表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，證實(shí)IL-1β和IL-8被TLR4激活后能進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，參與病程進(jìn)展。此外，本研究發(fā)現(xiàn)HUA組血漿IL-4、IL-10等抗炎性因子均顯著升高，提示機(jī)體通過(guò)免疫調(diào)節(jié)釋放抗炎性細(xì)胞因子，以便抑制和減輕由炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致的炎癥狀態(tài)?？傊接懺l(fā)性高血尿癥患者TLR4信號(hào)及其相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)變化，對(duì)于高尿酸血癥病程的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)之中的作用，預(yù)防合并癥的發(fā)生、發(fā)展有著重要的臨床意義。

[1]李復(fù)興. 飲水與高尿酸血癥[J].中國(guó)食品,2016，(3):36

[2]鄒大進(jìn).無(wú)癥狀高尿酸血癥治療的必要性[J].中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議指南，2014,(8):136-138

[3]趙勁濤，黃勝華，連希艷，等. 無(wú)癥狀高尿酸血癥對(duì)微炎癥狀態(tài)的影響[J].臨床內(nèi)科雜志, 2012, 29(7):460-462

[4]PaulPT,GarySF.NF-κB:akeyroleininflammatorydiseases[J].JClinInvest,2001，107(1):7-11

[5]ShawPJ,McDermottMF,KanneganitiTD.Inflammasomesandautoimmunity[J].TrendsinMolecularMedicine,2011,17(2):57-64

The study on the expression of TLR4 in patients with primary hyperuricemia

SUNJia-bin,LIXiao-guang,PANGDe-zhi,

ZHANGJin-bo,XIEWei-yu,ZHENGJia-yin,WANGMo-lin

(Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the expression of TLR4 signal pathway in patients with primary hyperuricemia. Methods: TLR4, NF-κB were measured by using Western-blot between experimental group and control group. The expressions of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 were measured by using ELISA in plasma with all groups. Results: The expression of TLR4、NF-κB gene protein increased significantly, and the expression of IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10 increased significantly in patients with experimental groups compared with control group. Conclusion: Dysregulated expression of TLR4, associated inflammatory and anti inflammatory cytokinesis with it may be involved in the development of disease by regulating inflammotatory response; and play a key role in the primary hyperuricemia.

TLR4;primary hyperuricemia;inflammation

1. 黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201610222051；2.黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題，編號(hào)：2014-264；3.佳木斯大學(xué)青年項(xiàng)目，編號(hào)：Sq2013-019；4.佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào)：JMSUJCM2016-043。

孫佳斌(1994～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科學(xué)生。

王茉琳(1981～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail:81molin@163.com。

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A

1008-0104(2017)01-0015-02

2016-10-20)