韓寧寧 ， 徐 嫄 ， 于麗娜 ， 戴 青 ， 趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京海淀100081)

鹽霉素效價測定的方法優(yōu)化

韓寧寧 ， 徐 嫄 ， 于麗娜 ， 戴 青 ， 趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京海淀100081)

在近期鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中發(fā)現(xiàn)存在抑菌圈過大的問題，導(dǎo)致其相互粘連無法進(jìn)行效價測定。通過菌株純化和更換培養(yǎng)基中瓊脂品牌及調(diào)整其濃度使抑菌圈直徑縮小至獸藥典規(guī)定的范圍內(nèi)。通過上述優(yōu)化措施保證了國家標(biāo)準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確性，更為同業(yè)人員效價測定遇到類似問題提供借鑒。

鹽霉素； 效價測定； 抑菌圈過大； 菌株純化； 瓊脂的選擇

鹽霉素是一種雞用防球蟲劑及仔豬、育肥豬的生長促進(jìn)劑[1]。1987年歐共體批準(zhǔn)使用，1993年中國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用。它屬于聚醚類一元羧酸抗生素，主要作用是通過干擾有害微生物生長，有效控制下痢的發(fā)病率和死亡率，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，保證和促進(jìn)畜禽的健康生長，改善飼料轉(zhuǎn)化率，提高經(jīng)濟(jì)效益。由于其結(jié)構(gòu)無紫外發(fā)色團(tuán)，《中國獸藥典》中該品種[1]采用效價法測定其含量。獸藥典規(guī)定三劑量法[2]進(jìn)行效價測定的抑菌圈直徑應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)品中劑量15～18 mm，在此范圍內(nèi)抑菌圈無相互干擾，效價測定結(jié)果準(zhǔn)確可信。而近期標(biāo)準(zhǔn)品制備過程中發(fā)現(xiàn)鹽霉素抑菌圈直徑過大，抑菌圈相互粘連影響測定。通過菌株純化和更換培養(yǎng)基中瓊脂品牌及調(diào)整其濃度使問題得以解決。

1 材料與方法

1.1 儀器材料與試藥 抗生素效價測量儀(北京潮聲技術(shù)開發(fā)公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)?？股豂V號培養(yǎng)基、pH值6.0的磷酸鹽緩沖液及滅菌水均由中海公司提供；鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號K0141106，效價單位948單位/mg。檢定菌CMCC(B)63202凍干管，購自于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 抑菌圈過大的解決方法 在效價測定條件摸索階段，發(fā)現(xiàn)鹽霉素抑菌圈過大，標(biāo)準(zhǔn)品中劑量抑菌圈直徑在26～27 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了獸藥典規(guī)定的15～18 mm[2]的范圍，各抑菌圈相互粘連(如圖1)，無法進(jìn)行測量。按照效價測定的常規(guī)思路，采用提高菌濃度和降低抗生素濃度的方法(如表1)以期使抑菌圈直徑減小，但抑菌圈依然粘連，無法達(dá)到預(yù)期效果。且調(diào)整后，菌懸液的濃度已經(jīng)達(dá)到效價測定常規(guī)菌濃的上限(菌懸液加入量繼續(xù)增大會影響培養(yǎng)基中各成分的比例)，抗生素濃度也已經(jīng)接近獸藥典規(guī)定的線性濃度范圍的下限(獸藥典規(guī)定鹽霉素管碟法抗生素濃度范圍為10～40單位/mL[2])。因此，擬進(jìn)一步從菌株純化和調(diào)整培養(yǎng)基中的瓊脂兩個方面進(jìn)行摸索。

圖1 鹽霉素抑菌圈相互粘連效果

1.2.1 菌株純化 用無菌接種環(huán)挑取生長于斜面上的少量檢定菌CMCC(B)63202，采用分區(qū)平板劃線法(如圖2)獲得典型單菌落。挑取單菌落置斜面培養(yǎng)1周，采用該純化后的菌株斜面進(jìn)行效價測定。

圖2 分區(qū)平板劃線法

表1 效價測定的常規(guī)條件摸索

1.2.2 更換培養(yǎng)基中的瓊脂品牌并調(diào)整其濃度 抗生素IV號培養(yǎng)基主要包含蛋白胨，酵母浸出粉，葡萄糖，瓊脂和水等5種成分。推測其中的瓊脂質(zhì)量及濃度為影響抗生素擴(kuò)散的主要因素。因此，在其他幾種成分來源及濃度不變的前提下，考察了3種不同品牌的瓊脂粉，并參考相應(yīng)凝膠強(qiáng)度及鋪就平皿上層的容易程度確定了其在培養(yǎng)基中的濃度(如表2)。

表2 瓊脂粉品牌及濃度摸索

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株純化對抑菌圈直徑的影響 菌株純化后，同樣采用原液3%菌懸液濃度，標(biāo)準(zhǔn)品中劑量抑菌圈直徑由26～27 mm縮小為21～22 mm，雖然仍不在獸藥典規(guī)定的范圍內(nèi)，但各抑菌圈已不再粘連。說明純化后非典型菌落去除，短小芽孢桿菌菌懸液中的活性孢子濃度提高，所以即便采用與之前相同的菌懸液濃度仍可使抑菌圈直徑縮小。

2.2 培養(yǎng)基中瓊脂品牌及濃度對抑菌圈直徑的影響 在菌懸液濃度、培養(yǎng)基配方中其他成分的來源及濃度均相同的前提下，發(fā)現(xiàn)配方3美國BD公司的瓊脂粉濃度為15 g/1 000 g時可以使抑菌圈直徑落在獸藥典規(guī)定范圍內(nèi)(如圖3)。

表3 瓊脂對抑菌圈直徑的影響

3 討論

3.1 從試驗結(jié)果可知，即便將菌株純化且優(yōu)化了瓊脂來源及濃度后，仍然需要原液3%高菌懸液濃度才可以保證抗生素抑菌圈直徑落在獸藥典規(guī)定范圍，且接近范圍的上限。推測可能是由于菌株凍干粉在存放過程中活力降低，活性孢子量減少所致。

3.2 獸藥典中對于效價測定用培養(yǎng)基中瓊脂的濃度均規(guī)定為15～20 g/1 000 g[2]。而實際配制過程中，除需要參考瓊脂粉的凝膠強(qiáng)度外，還需要考察其制備的斜面是否在接種時無側(cè)滑轉(zhuǎn)動、平皿的上層是否在規(guī)定溫度范圍內(nèi)容易鋪就等。而該濃度有可能不在規(guī)定范圍內(nèi)。如果完全按照獸藥典的瓊脂粉規(guī)定濃度配制培養(yǎng)基，會導(dǎo)致某些培養(yǎng)基的菌碟上層無法均勻鋪就。

[1] 鹽霉素鈉.中國獸藥典委員會.[S].中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部，221.

[2] 抗生素微生物檢定法.中國獸藥典委員會[S].中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部附錄121-128.

Optimization of the Method for the Potency Determination of Salinomycin

HAN Ning-ning , XU Yuan , YU Li-na , DAI Qing , ZHAO Hui

(China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China)

During the recent preparation of the reference standard of salinomycin,we found that the diameters of the antibacterial circles were too big so that the potency determination could not be carried out because of their mutual adhesion.Through the strain purification and replacement of the agar in the culture medium and adjustment of the agar concentration,the antibacterial circle diameters were reduced to the scope of the provisions of the veterinary pharmacopoeia.These improvements ensured the accuracy of the assignment of the national standard,and provided the reference for the peers when they meet the same problems during the potency determination.

salinomycin;potency determination;too big diameters of the antibacterial circles;strain purification;selection of agar

ZHAO Hui

2016-09-23

韓寧寧(1984- )，女，助理研究員，碩士，從事抗生素檢驗工作，E-mail：hnn19841001@126.com

趙暉，E-mail:171977364@qq.com

TQ460.6

A

0529-6005(2017)02-0093-02