李 佳 ， 李亞娟 ， 胡俊菁 ， 杜玉蘭 ， 何寶祥

(廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 廣西南寧530005)

奶牛乳房炎主要致病菌DNA不同提取方法的比較

李 佳 ， 李亞娟 ， 胡俊菁 ， 杜玉蘭 ， 何寶祥

(廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 廣西南寧530005)

采用不同DNA 提取方法，比較提取奶牛乳房炎主要致病菌DNA(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌)的效果。對(duì)菌液和牛奶樣品，分別用堿性裂解法、煮沸法、試劑盒法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法提取細(xì)菌DNA ，并比較DNA濃度、純度和PCR擴(kuò)增結(jié)果。發(fā)現(xiàn)5種方法所得DNA在濃度、純度和PCR擴(kuò)增效果上差別較大。結(jié)論是提取上述致病菌DNA，求純選擇試劑盒法或水煮法，求速選擇苯酚-氯仿法。

奶牛乳房炎 ； 細(xì)菌 ； DNA提取

奶牛乳腺炎是一種奶牛常見疾病，給奶牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。病原菌感染是引起該病的最主要原因。PCR檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、效率高，其中模板的制備尤為關(guān)鍵。應(yīng)用不同機(jī)理和步驟的提取方法，獲得DNA的量及純度也各不相同。本文對(duì)堿性裂解法、煮沸法、試劑盒法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法進(jìn)行比較，旨在為合理選取奶牛乳房炎主要致病菌DNA 提取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌FSCC149005、金黃色葡萄球菌FSCC223005、無乳鏈球菌CVCC1887均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑 溶菌酶、蛋白酶K、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24:1)，購自北京索萊寶科技有限公司；UHT乳，購自超市。

1.3 主要儀器 超微量分光光度計(jì)(NanoDrop-2000 C)、PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.4 引物 3種菌引物均參考文獻(xiàn)[1]，大腸桿菌rrnb基因(722 bp)，上游引物:5'-ACGGCAAAGT GTGGGTCAAT-3'；下游引物:5'-AGCGTAAGGGTAATGCGAGG-3'。金黃色葡萄nuc基因(464bp)，上游引物:5'-GAAAGGGCAATACGCAAAGAG-3'，下游引物:5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3'。無乳鏈球菌sip基因(253bp)，上游引物:5'-TATTCTTCTGCGCCAGCTTTG-3'，下游引物:5'-GGGCTGCTAC AGTTCTTACCG-3'。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

1.5 樣品制備 將3種菌增菌，分別取1 mL菌液于EP管，每種菌對(duì)應(yīng)的5法各設(shè)3個(gè)平行，12 000 r/min 離心2 min，棄上清。收集菌體分別按下述5法處理。分別向菌體中添加純?nèi)鉁图兡?，作為?種方法和后2種方法的樣品，并設(shè)純?nèi)鉁图兡虨殛幮詫?duì)照。

1.6 DNA提取方法 堿性裂解法、煮沸法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法具體步驟見文獻(xiàn)[2-5]。試劑盒提取方法見試劑盒說明書。陰性對(duì)照均以苯酚-氯仿法處理。

1.7 DNA濃度及純度測(cè)定 超微量分光光度計(jì)(NanoDrop-2000C)檢測(cè)DNA模板濃度和純度，每個(gè)樣品檢測(cè)3次并取平均值。A260/A280值來衡量蛋白質(zhì)的去除情況[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度 細(xì)菌DNA 濃度見表1，試劑盒法提取DNA的濃度均最低；苯酚-氯仿法的均最高。3種菌比較，可知DNA提取濃度與細(xì)菌結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。結(jié)果為平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(%)。

2.2 DNA純度 細(xì)菌DNA 純度見表2，僅試劑盒法與煮沸法DNA純度接近1.8；提取牛奶中細(xì)菌DNA的2種方法純度最低，表明模板中蛋白雜質(zhì)較多。結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 PCR擴(kuò)增 由圖1可知，同一種菌的5種方法所提DNA擴(kuò)增條帶明暗程度差異較大，與DNA純度大小趨勢(shì)相一致，即DNA純度越高擴(kuò)增效果越好。

表1 細(xì)菌DNA 濃度 (ng/μL)

表2 細(xì)菌DNA 純度

3 討論

奶牛乳房炎主要致病菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌3種[7]。大腸桿菌為革蘭陰性菌，細(xì)胞壁薄，易于破壁；金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌為革蘭陽性菌，細(xì)胞壁厚而致密，因此破壁是關(guān)鍵。5種提取方法機(jī)理和步驟不同，因此DNA濃度和純度差異較大，如堿性裂解法破壁能力強(qiáng)且操作簡(jiǎn)便，減少了DNA損失，DNA濃度高但純度低；而溶解酶法受菌量，酶抑制劑等因素影響較大，DNA純度低且異丙醇?xì)埩簦琍CR擴(kuò)增效果差。

樣品方面，與菌液肉湯相比，牛奶成分更復(fù)雜，存在干擾DNA提取和PCR擴(kuò)增的物質(zhì)[8]，因此直接提取牛奶中細(xì)菌DNA的量與純度均低于先增菌再提取DNA的方法，而它的優(yōu)勢(shì)在于DNA提取速度快。若通過提取方法改進(jìn)可實(shí)現(xiàn)高敏感性和高速的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，更高效率地提取奶牛乳房炎致病菌DNA，為乳房炎診斷爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間，避免因診斷耗時(shí)而造成進(jìn)一步經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)比較先增菌再提取DNA和直接提取牛奶中細(xì)菌DNA兩種情況得出的結(jié)論為：求純選擇試劑盒法或水煮法，求速選擇苯酚-氯仿法。

[1] 陳亞明. 奶牛乳房炎致病菌分離鑒定及快速診斷試劑盒的研發(fā)與應(yīng)用[D].南寧：廣西大學(xué),2014.

[2] 錢雪琴,張軍,沈芳. Chelex-100法和堿性裂解法提取細(xì)菌DNA的比較[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,08:1565-1566.

[3] 馮廣達(dá),陳美標(biāo),羊宋貞,等. 用于PCR擴(kuò)增的細(xì)菌DNA提取方法比較[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,03:439-442.

[4] P. Phuektes P D， Mansell G F. Browning, Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay for Simultaneous Detection of aureus andStreptococcal Causes of Bovine Mastitis [J].Journal of Dairy Science, 2001,184(5):1140-1148.

[5] 洪穎,肖震,祝長(zhǎng)青,等. 牛奶中無乳鏈球菌DNA提取方法的比較[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,12:4832-4838.

[6] 李進(jìn)波,盛婧,李想,等. 五種DNA提取方法對(duì)魚加工制品DNA提取效果的比較[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2014,04:43-49.

[7] Andres C G,Juan Miguel R.Mastitis:comparative etiology and epidemiology[J]. Journal of Mammary Gland Biology & Neoplasia，2011, 16:339-356.

[8] Riffon R, Sayasith K, Khalil H,etal.Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001,39(7):2584-2589.

2016-02-24

南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)科技局項(xiàng)目(2014308)

李佳(1991-)，女，碩士生，從事奶牛乳房炎檢測(cè)方法研究，E-mail:lijiamilk@163.com

何寶祥，E-mail:hebaox@gxu.edu.cn

S858.23

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0529-6005(2017)02-0040-02