王利杰

摘 要：采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測了發(fā)酵液中維生素B12的含量，使用費氏丙酸桿菌細(xì)胞破碎提取維生素B12。結(jié)果顯示，羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素的回收率分別為92.43%，97.56%和96.45%.費氏丙酸桿菌的質(zhì)量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經(jīng)超聲波破碎，經(jīng)測定，維生素B12的產(chǎn)量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。維生素B12經(jīng)微波加熱法獲得的提出率最大，其次為煮沸法、超聲法和高壓均質(zhì)法。HPLC具有良好的重復(fù)性和較快的分析速度，而在費氏丙酸桿菌細(xì)胞破碎提取中，微波加熱法和煮法法值得推廣。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵液；維生素B12；高效液相色譜法；超聲波

中圖分類號：TQ924 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2016.22.106

維生素B12又被稱為鈷胺素，主要是通過微生物發(fā)酵獲取的，其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面。在實踐中，常見的檢測方法有微生物法、間接檢測法等，其中，HPLC的使用頻率最高。但是，因為維生素B12的發(fā)酵周期過長、發(fā)酵物種繁多，所以，急需構(gòu)建準(zhǔn)確、簡便、高效的檢測方法。目前，關(guān)于維生素B12的檢測和提取的研究報道比較少。因此，本文利用HPLC檢測了維生素B12，并借助大孔樹脂吸附法進行了提取，效果顯著，具體情況如下。

1 實驗材料

實驗一：費氏丙酸桿菌，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的玉米漿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的硫酸銨，高效液相色譜儀，超聲波細(xì)胞破碎儀，高速離心機，大容量離心機，純水機，分析純，色譜柱為5 μm，（4.7×25.0）cm。

實驗二：菌種、培養(yǎng)基同實驗一，采用高效液相色譜儀，高速離心機，大容量離心機，超聲波細(xì)胞破碎儀，微波爐，高壓均質(zhì)機，考馬斯亮藍染液，色譜柱5 μm，（4.7×25.0）cm。

2 實驗方法

實驗一：培養(yǎng)費氏丙酸桿菌，利用生理鹽水清洗菌體，靜置30 ℃，培養(yǎng)50 h。接種發(fā)酵培養(yǎng)基后，靜置30 ℃，培養(yǎng)100 h，發(fā)酵后40 h，添加二甲基苯并咪唑，誘導(dǎo)菌體，積累維生素B12，離心4 000 r/min，獲取菌體。具體實驗有，重復(fù)性實驗、穩(wěn)定性試驗、回收率實驗，即稱取5份菌體，質(zhì)量相同，制備樣品，添加等量羥基鈷胺素和甲基鈷胺素，置于4 ℃冰箱內(nèi)，避光保存，檢測間隔時間為1 h/次，分析樣品5 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

實驗二：配置不同濃度的血清白蛋白溶液，取0.1 mL，加入考馬斯亮藍染液5 mL。維生素B12的提取方法有4種，即超聲法，稱取菌體，放置在小燒杯內(nèi)，離心后，溶解菌體，選取不同時間，探討其提取效率，取上清，測定蛋白質(zhì)釋放率，除蛋白質(zhì)后測定維生素B12的含量；煮沸法，定容后，煮沸，離心，過濾上清液后，測定維生素B12的含量。此外，還包括微波加熱法和高壓均質(zhì)法，此處不一一闡述。

3 實驗結(jié)果

實驗一：細(xì)胞破碎液處理后，獲得了HPLC色譜圖，羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素均在25 min內(nèi)完全分離，各自保留時間為10.9 min、18.5 min、22.4 min，細(xì)胞破碎液中雜質(zhì)6 min內(nèi)被洗脫，借助梯度洗脫，分離了脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。三類不同濃度的鈷胺素與色譜峰面積呈線性關(guān)系，因其對光線敏感，操作時應(yīng)避光，質(zhì)量濃度為10～200 μg/mL，三者線性關(guān)系良好。維生素B12經(jīng)重復(fù)性實驗，5次實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.5%，均在允許誤差范圍內(nèi)。此結(jié)果表明，儀器具有較高的精密度，分析方法具有良好的重復(fù)性。穩(wěn)定性實驗，維生素B12置于避光環(huán)境中，5 h內(nèi)穩(wěn)定，三者的回收率分別為92.43%，97.56%，96.45%. 費氏丙酸桿菌的質(zhì)量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經(jīng)超聲波破碎，測定維生素B12的產(chǎn)量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。

實驗二：費氏丙酸桿菌菌體采取不同的方法提取維生素B12，提出率最大的為微波加熱法，其次為煮沸法、超聲法和高壓均質(zhì)法，分別為100.00%，97.67%，89.65%和88.63%.

4 討論

經(jīng)微生物發(fā)酵獲取維生素B12常見的有羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。為了快速測定發(fā)酵液中維生素B12的含量，本文采用了HPLC方法，離心后，得到了菌體，待預(yù)處理后使用醋酸鈉緩沖液為流動相。實驗結(jié)果為檢測方法精準(zhǔn)。在鈷胺素類物質(zhì)檢測中使用HPLC，優(yōu)勢顯著，準(zhǔn)確、快速，具有良好的重復(fù)性。因此，該方法可用于鈷胺素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。在實踐過程中，可以對維生素B12進行定量分析，其應(yīng)用價值顯著，值得推廣。

維生素B12為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，在提取時關(guān)鍵環(huán)節(jié)便是破碎細(xì)胞，其對產(chǎn)物有直接的影響，比如活性、收率、成本等。因此，在實踐過程中，應(yīng)確保細(xì)胞破碎方法具有合理性、針對性和有效性。目前，常見的細(xì)胞破碎方法有2種，一種為機械法，另一種為非機械法，前者包括株磨法、超聲波法，后者包括化學(xué)法、物理法等。為了指導(dǎo)實踐，使維生素B12提取更加簡便，本文對比了不同提取方法，取得了良好的效果。其中，微波加熱法的提取時間最短，但是，在工業(yè)應(yīng)用中，需要借助大型配套設(shè)備。此外，煮沸法優(yōu)點顯著，提取效率高，處理量大，僅需簡單的設(shè)備，值得推廣。

參考文獻

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〔編輯：白潔〕