張圓芳，何堅，柳維林，董繼泉（福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州350122）

寒濕型兔頸型頸椎病模型的建立與評估

張圓芳，何堅，柳維林，董繼泉
（福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州350122）

目的建立兔的頸型頸椎病模型。方法以低頭位加寒濕刺激法建立兔頸型頸椎病模型，用HE染色法觀察頸肌、椎間盤形態(tài)學變化，用Elisa法觀察兔血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平。結(jié)果與正常組比較，模型組頸肌細胞腫脹變形，肌纖維斷裂，出現(xiàn)炎癥細胞；椎間盤髓核細胞破裂，纖維環(huán)區(qū)出現(xiàn)大量炎癥細胞和多處壞死;血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著升高（P＜0.01）。與造模前比較，模型組造模后血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論低頭位加寒濕刺激法可成功建立兔頸型頸椎病動物模型，其血清炎癥水平顯著性升高。該模型及其評估方法，操作簡單，無創(chuàng)、適用性強。

頸型頸椎?。淮蟀淄貌±砟Ｐ?；評估

在實驗動物上模擬頸型頸椎病，是目前研究頸型頸椎病的重要途徑之一［1］。查閱文獻可發(fā)現(xiàn)采用低頭架固定建立頸型頸椎病動物模型［2-3］的方法操作簡單，且對所需觀察組織無直接干擾。但對此模型的驗證至今尚未形成統(tǒng)一標準［4］。我們參照張欣等［5］無創(chuàng)兔頸型頸椎病動物模型的建立方法進行改良，建立兔頸型頸椎病模型，通過檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平來評估該模型是否成功［6］，以期為頸型頸椎病動物模型的建立提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組6月齡健康清潔級新西蘭大白兔24只（動物批號：2007001104542），雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0011。根據(jù)隨機數(shù)字表分為正常組和模型組，每組12只。

1.2 實驗藥物、試劑及器材兔子固定器（蘇州市蘇杭科技器材有限公司）；剃毛器（福州沃森生物技術(shù)有限公司）；冰袋（自制）；Elisa試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；一次性使用靜脈血樣采集針（山東成武賽諾醫(yī)療器械有限公司）；一次性使用真空采血促凝劑管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；4%多聚甲醛（索萊寶生物科技有限公司）；EDTΑ-2Nα（天津市福晨化學試劑廠）；無水乙醇（西隴化工股份有限公司）；蘇木素、伊紅染液（索萊寶生物科技有限公司）；粘附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；包埋機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；萊卡切片機、電子顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）；烤片機（上海市躍進醫(yī)療器械廠）。

1.3 模型制備參照張欣等［3］無創(chuàng)兔頸型頸椎病動物模型的建立方法進行改良造模。2組動物在動物房適應(yīng)環(huán)境1周后，采集血液，用Elisa試劑盒檢測兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平，作為造模后這些炎癥因子的檢測基線，然后進行造模。模型組12只兔子用剃毛器剔去頸部毛發(fā)，置于改造后的兔子固定器中，使兔的頸部成低頭屈曲位45°，后頸部肌肉呈牽拉狀態(tài)，同時敷以自制保濕冰袋，調(diào)節(jié)冰袋松緊并將其固定于兔子固定器兩側(cè)。每次造模5 h，每日1次，共56 d。模型組兔每天固定結(jié)束后常規(guī)飼養(yǎng)于兔籠中，正常飲食飲水，自由活動。正常組兔子常規(guī)飼養(yǎng)于籠中，正常飲食飲水。注意每天觀察每只動物精神狀態(tài)、飲食、運動、大小便等一般情況，每周稱體質(zhì)量1次。

1.4 標本取材造模結(jié)束后次日正常組和模型組兔的耳緣靜脈采血，觀察模型組兔頸后肌肉硬度變化情況。每只兔采血5 mL置于離心管，4℃環(huán)境下及時以3 500 r／s離心20 min，吸取上清液，注入無菌Eppendorf管內(nèi)，-80℃冰箱內(nèi)保存待測。

取血后耳緣靜脈空氣栓塞處死，迅速在兔經(jīng)筋頸部的起止點周圍部位剪取組織，在C3-6棘突旁2 cm處取皮下肌肉組織1 cm×1 cm×1 cm，置4%多聚甲醛中48 h，修剪組織水平面和橫斷面，長1 cm，寬0.5 cm，厚0.3～0.4 mm，放入70%酒精過夜，第2天進行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。

取下頸肌后，繼續(xù)分離剩下的肌肉組織，用咬骨鉗取下整段頸椎，尖刀鈍性分離出C4－5椎間盤組織，置4%多聚甲醛中48 h，然后換10%脫鈣液進行脫鈣2～3個月。以注射器針頭扎進時，無明顯阻力為宜。包埋前修剪出組織橫切面，大小同上頸肌組織，然后放入70%乙醇過夜，第2天80%乙醇2 h，90%乙醇2 h，95%乙醇2 h，100%乙醇30 min，100%乙醇30 min，100%乙醇2 h，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ15-20 min，蠟Ⅰ15 min，蠟Ⅱ15 min，蠟Ⅲ60 min，石蠟包埋。

1.5 光鏡下頸肌和椎間盤組織形態(tài)學觀察正中冠狀位切片，厚度5～6 μm，撈片后自然晾干，60℃烤箱2～3 h，放入4℃冰箱保存，HE染色。染色前將切片置于37℃烘箱30 min，進行脫水和染色：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ15 min，100%乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，自來水浸泡30 s／次，共2次，自來水浸泡5 min，蘇木素5 min，自來水浸泡30 s，鹽酸分色3 s，自來水浸泡30 s，返藍30 min，伊紅1 s，自來水浸泡30 s，吹風機吹干，封片，晾干后拍片即光學顯微鏡觀察的肌肉和椎間盤組織形態(tài)學變化。

1.6 Elisa檢測兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平按說明書進行操作。標品和樣品做復孔，IL-1β和IL-6的標準曲線均是從1 000 pg／mL開始，減半遞減，共8個主孔及相應(yīng)復孔，TNF-α的標準曲線是2 000 pg／mL開始，減半遞減，共8個主孔及相應(yīng)復孔。加樣前先配好指標各梯度的標準樣品液，具體步驟：標準品及樣品主、復孔各加入相應(yīng)液體100 μL／孔，震蕩均勻后封閉，37℃烘箱孵育40 min。洗板4～6次，每次震蕩30～60 s，最后1次洗板后拍板至孔底部無水跡為宜。每孔加蒸餾水和第一抗體工作液（除空白孔外）50 μL，震蕩均勻后封閉，37℃烘箱孵育20 min，洗板，同前。每孔加酶標抗體工作液100 μL，震蕩均勻后封閉，37℃烘箱孵育10 min，洗板，同前。每孔避光加底物工作液100 μL，震蕩均勻后封閉，37℃烘箱孵育15 min。每孔加終止液100 μL，震蕩均勻后，30 min內(nèi)酶標儀檢測OD值。

2 結(jié)果

2.1 頸肌組織形態(tài)學HE染色觀察正常組頸肌縱切面肌細胞呈長條狀整齊排列，細胞核橢圓形，肌原纖維沿細胞長軸排列，明暗帶清晰；模型組頸肌縱切面肌細胞腫脹變形，肌原纖維排列不整齊，明暗帶消失，肌纖維斷裂處存在炎癥細胞，主要為巨噬細胞。正常組頸肌橫切面肌組織排列整齊；模型組頸肌橫切面纖維斷裂，出現(xiàn)炎癥細胞，主要為巨噬細胞。

2.2 頸椎間盤組織形態(tài)學HE染色觀察正常組頸椎間盤髓核細胞完整，排列規(guī)整，髓核外周包繞的是纖維環(huán)，其細胞為長梭狀，膠原纖維呈致密板層狀排列有序，髓核和纖維環(huán)之間界限清晰；模型組頸椎間盤髓核出現(xiàn)皺縮，細胞破裂甚至壞死，纖維環(huán)排列較正常組雜亂，出現(xiàn)大量炎癥細胞和壞死。

2.3 血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平比較見表1、表2。

表1 2組IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較

表1 2組IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較

注：與正常組比較，1）P＜0.01。

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表2 模型組造模前后IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較pg／mL

表2 模型組造模前后IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較pg／mL

注：與造模前比較，1）P＜0.01。

組別造模后造模前n 12 12 IL-1β 15.074±1.0791）5.725±0.762 IL-6 9.416±1.0491）3.968±0.354 TNF-α 16.678±3.0211）5.968±0.267

3 討論

實驗通過檢測兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平來評估低頭位加寒濕刺激法制作的兔頸型頸椎病模型是否成功，結(jié)果顯示模型組兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平高于正常組；模型組造模后的血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平高于造模前。結(jié)果說明通過檢測兔血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平來評價兔頸型頸椎病模型建立成功與否的評估方法，操作簡單，無創(chuàng)，適用性強，有利于后續(xù)干預實驗的進行。

［1］陳志達，林斌，李炳文，等.頸椎病動物模型的研究進展［J］.風濕病與關(guān)節(jié)炎，2014，3（8）：57-61.

［2］林強，苑潔，鐘力煒，等.頸型頸椎病家兔模型的Ca2+-ATP酶及SOD、MDA含量變化［J］.按摩與康復醫(yī)學，2014，5（11）：202-203.

［3］張義，劉福水，鐘鼎文，等.長期異常應(yīng)力對家兔頸后肌肌外膜膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（8）：818-820.

［4］肖顯俊，馮躍，陳香竹，等.自制低頭架制作家兔頸椎病模型［J］.按摩與康復醫(yī)學，2015，6（2）：122-124.

［5］張欣，李殿寧，李開平，等.無創(chuàng)兔頸型頸椎病動物模型的建立［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（4）：913-916.

［6］張紅利，沈霖.頸椎病兔模型TNF-а、SP、NPY、CGRP的變化及意義［J］.數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2012，25（4）：410-412.

R-332

A

1000-338X（2017）01-0026-02

2016－10－18

國家自然科學基金資助課題（8157150620）

張圓芳（1988—），女，2014級中醫(yī)康復學專業(yè)碩士研究生，主要從事骨關(guān)節(jié)病康復的基礎(chǔ)研究。

何堅（1970—），男，副教授。E-mail：591003659@qq.com