林若蕓　馮貴雪　張波　周紅　汪彩珠　陳煥華　舒金輝　黃映琴

人類輔助生殖技術(shù)中，如何獲得高質(zhì)量的胚胎進(jìn)行移植以獲得理想的臨床結(jié)局，一直是生殖醫(yī)學(xué)工作者不懈努力的目標(biāo)。研究表明，精卵孵化時(shí)間過長產(chǎn)生高水平活性氧(ROS)可獨(dú)立誘導(dǎo)DNA損傷，不但破壞精子膜的流動(dòng)性和完整性，還可導(dǎo)致DNA單鏈形成或雙鏈斷裂[1-2]，從而影響人類輔助生殖技術(shù)的妊娠結(jié)局[3-4]。當(dāng)精子DNA損傷小于8%時(shí)，卵子具有修復(fù)DNA損傷的能力，超過這個(gè)范圍將影響胚胎的發(fā)育潛能，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止、流產(chǎn)和胎兒畸形等[5-6]。然而，精卵孵育時(shí)間的長短是否對圍產(chǎn)兒健康狀況產(chǎn)生影響未見報(bào)道。本研究探討精卵共孵育時(shí)間對妊娠結(jié)局及圍產(chǎn)兒健康狀況的影響，以期為提高人類輔助生殖技術(shù)的效率及安全性提供依據(jù)。

對象與方法

一、對象

選擇2013年1月—2014年12月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖中心行常規(guī)體外受精的3 323例患者，共3 368個(gè)取卵周期，隨機(jī)分成精卵孵育時(shí)間縮短組和傳統(tǒng)受精組：孵育時(shí)間縮短組1 968例患者，共1 996個(gè)取卵周期，患者年齡范圍為20～46歲，平均(32.3±4.7)歲，獲卵數(shù)范圍為1～46枚，平均獲卵(12.2±7.3)枚；傳統(tǒng)受精時(shí)間組1 355例患者，共1 372個(gè)取卵周期，傳統(tǒng)受精方式，精卵過夜孵育16～18h，患者年齡范圍為20～46歲，平均(32.4±4.5)歲，獲卵數(shù)范圍為1～53枚，平均獲卵(12.2±7.53)枚，比較兩組的年齡及獲卵數(shù)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

二、方法

1. 控制性超排卵：采用本中心常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotrophin-releasing hormone agonist, GnRHa)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)促排卵方案。陰道B超和激素測定監(jiān)測卵泡生長，當(dāng)1個(gè)優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm或2個(gè)優(yōu)勢卵泡≥17 mm時(shí)肌注HCG 10 000 IU，34～36 h后陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

2.精液采集及處理：丈夫禁欲3～7 d，以手淫法收集當(dāng)天新鮮精液，采用密度梯度離心法洗滌，后通過上游制作受精滴。根據(jù)卵子數(shù)目做成數(shù)個(gè)100μl授精滴(每受精滴可加入卵子3～8個(gè))，置37℃、5%CO2，培養(yǎng)箱中平衡。

3.受精：取卵后3～4 h(HCG后39～40 h)把卵子加到預(yù)先制作的受精滴中，孵育時(shí)間縮短組精卵孵育3～4 h將卵子轉(zhuǎn)移至新鮮的已平衡過的受精培養(yǎng)滴中；傳統(tǒng)受精組，精卵孵育過夜16～18h。兩組均于受精后16～18 h,采用機(jī)械的方法去除顆粒細(xì)胞，清洗后轉(zhuǎn)入卵裂培養(yǎng)液中，觀察受精情況。

4.胚胎評分及囊胚培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[7]方法,胚胎培養(yǎng)第三天(D3)根據(jù)卵裂球形態(tài)、大小及碎片量、卵裂球空間分布、胞漿均質(zhì)情況等進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分，根據(jù)胚胎的情況及病人的條件確定是卵裂期胚胎移植還是囊胚移植。

5.臨床妊娠觀察：胚胎移植后第14d檢測尿、血hCG陽性者為生化妊娠，移植后4～6周B超見宮內(nèi)妊娠囊為臨床妊娠。

6.評價(jià)指標(biāo)及計(jì)算公式：兩組間胚胎發(fā)育情況比較采用成熟率(MⅡ卵數(shù)/總獲卵數(shù)×100%)、正常受精率(正常受精卵數(shù)/總獲卵數(shù)×100%)、多精受精率(多精受精卵數(shù)/總獲卵數(shù)×100%)、冷凍率(有胚胎冷凍的周期/總?cè)÷阎芷凇?00%)、優(yōu)胚率(總優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/總正常受精胚胎數(shù)×100%)、囊胚率(總囊胚形成數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%)、胚胎利用率(可利用的胚胎數(shù)/總正常受精胚胎數(shù)×100%)等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)；妊娠結(jié)局采用生化妊娠率(生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、種植率(孕囊數(shù)目/移植的胚胎數(shù)目×100%)、流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)、異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)；新生兒健康狀況采用移植周期活產(chǎn)率(活產(chǎn)分娩數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、低出生體重兒率(低出生體重兒分娩數(shù)/活產(chǎn)分娩數(shù)×100%)和極低出生體重兒率(極低出生體重兒分娩數(shù)/活產(chǎn)分娩數(shù)×100%)等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。

結(jié)　　果

一、胚胎發(fā)育情況的比較

精卵孵育時(shí)間縮短組和傳統(tǒng)受精組的成熟率分別為76.1%、76.9%，多精受精率分別為6.8%、6.9%，冷凍率分別為72.9%、71.1%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。孵育時(shí)間縮短組的正常受精率、優(yōu)胚率、囊胚率及胚胎利用率分別為70.1%、49.7%、46.0%、52.1%，高于傳統(tǒng)受精組(分別為68.2%、48.4%、30.3%、50.9%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　兩組胚胎發(fā)育情況的比較[%(例)]

注：*兩組比較，P<0.05

二、臨床妊娠結(jié)局的比較

精卵孵育時(shí)間縮短組的生化妊娠率(54.6%) 、臨床妊娠率(49.2%)、種植率(37.5%)及移植周期活產(chǎn)率(38.9%)與傳統(tǒng)受精時(shí)間組(51.2%、45.5%、35.0%、 37.4%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，多胎妊娠率、單卵雙胎率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、死胎/死產(chǎn)率，兩組比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

三、新生兒結(jié)局的比較

精卵孵育時(shí)間縮短組共分娩740個(gè)嬰兒，其中單胎分娩544個(gè)嬰兒，雙胎分娩196個(gè)嬰兒。傳統(tǒng)受精組共分娩477個(gè)嬰兒，其中單胎分娩349個(gè)嬰兒，雙胎分娩128個(gè)嬰兒。兩組新生兒按照胎數(shù)進(jìn)行分層比較，結(jié)果顯示無論單胎還是雙胎，兩組在孕周、出生體重、低出生體重兒和極低出生體重兒發(fā)生率、身長、Apgar評分及出生畸形率上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2　兩組臨床妊娠結(jié)局的比較

表3　兩組新生兒出生結(jié)局的比較

討　　論

人類輔助生殖技術(shù)已跨入以高效、安全為主題的時(shí)代，關(guān)于子代的安全性的問題受到更多的關(guān)注。已有較多的研究表明，縮短精卵相互作用的時(shí)間可明顯提高胚胎的質(zhì)量[8-10]。但關(guān)于精卵孵育時(shí)間長短對新生兒健康狀況的研究未見報(bào)道。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，卵子與高密度精子長時(shí)間作用，精子代謝產(chǎn)物堆積，不僅消耗培養(yǎng)液的能量，而且驅(qū)散的顆粒細(xì)胞及死精子等都可使卵細(xì)胞處于一個(gè)營養(yǎng)不良的環(huán)境中[11]。短時(shí)受精縮短了卵子暴露于過量代謝產(chǎn)物中的時(shí)間，在一定程度上起到了改善胚胎質(zhì)量的作用，且短時(shí)受精后卵子周圍會剩余1～3層的顆粒細(xì)胞，可作為共培養(yǎng)細(xì)胞，可分泌一些對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì)和去除培養(yǎng)環(huán)境中對早期胚胎發(fā)育不利的物質(zhì)[8]。Enkhmaa等[12]分別檢測了精卵共孵育4h與18h后授精培養(yǎng)液中活性氧ROS的濃度，結(jié)果表明，縮短精卵共孵育時(shí)間，ROS濃度降低，胚胎質(zhì)量也有顯著改善。當(dāng)精液質(zhì)量差時(shí)，常合并附睪性腺炎癥，造成內(nèi)細(xì)胞增多，精子活力下降及活性氧增多，從而對胚胎質(zhì)量的影響更嚴(yán)重[13]。本研究結(jié)果顯示精卵孵育時(shí)間縮短組的正常受精率高于傳統(tǒng)受精時(shí)間組，且優(yōu)胚率、囊胚率及胚胎利用率均高于傳統(tǒng)受精時(shí)間組。因此本研究表明，縮短精卵孵育時(shí)間有效胚胎的發(fā)育潛能及胚胎的利用效率，與Kattera[9]、Bungum等[10]的研究結(jié)果一致，縮短精卵孵育時(shí)間更符合人類自然生理狀況，是一種簡便有效的受精方式。

目前對于縮短精卵孵育時(shí)間是否影響臨床妊娠結(jié)局，仍存在著爭論。屈宗銀等研究[14-15]認(rèn)為短時(shí)受精可改善妊娠結(jié)局。代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的有害物質(zhì)，加速透明帶硬化，故縮短精卵孵育時(shí)間可防止透明帶過早硬化，使囊胚易于孵出，提高了胚胎植入率。但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)短時(shí)受精并不影響臨床結(jié)局[16-17]。這可能與各IVF實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)方法、精卵共孵育時(shí)所加的精子量、研究設(shè)計(jì)及病例選擇等不同有關(guān)。本研究表明，精卵孵育時(shí)間縮短組的生化妊娠率、臨床妊娠率、種植率及活產(chǎn)率均稍高于傳統(tǒng)受精時(shí)間組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而多胎妊娠率、單卵雙胎率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、死胎/死產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，關(guān)于縮短精卵孵育時(shí)間是否改善臨床結(jié)局，其結(jié)論還需要更多研究數(shù)據(jù)來證明。

目前關(guān)于精卵孵化時(shí)間對新生兒結(jié)局的研究報(bào)道頗為匱乏。精卵共孵育過程中產(chǎn)生活性氧(ROS)等有害物質(zhì)造成精子的DNA損傷，從而影響妊娠結(jié)局[18]。Benchaib[6]等研究發(fā)現(xiàn)精子DNA 損傷可導(dǎo)致受精失敗、胚胎發(fā)育停止、流產(chǎn)和胎兒畸形等?？s短精卵孵育時(shí)間可以使卵子盡早脫離高活性氧、高DNA損傷精子的環(huán)境，那么由于孵育時(shí)間過長所造成的一定程度精子DNA損傷是否與新生兒健康狀況相關(guān)值得深入探討。本研究中兩組的單胎和雙胎在孕周、出生體重、低出生體重兒和極低出生體重兒發(fā)生率、身長、評分上差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組嬰兒出生畸形率亦無明顯差異，故本研究結(jié)果說明孵育時(shí)間不影響子代的安全性，但需大樣本量進(jìn)一步加強(qiáng)對新生兒健康狀況的綜合評價(jià)，以充分評估精卵孵化時(shí)間對助孕后子代的長遠(yuǎn)影響。

總之，IVF-ET總是致力于為病人提供最優(yōu)質(zhì)的胚胎用于移植，選擇縮短精卵孵育時(shí)間可以優(yōu)化IVF受精方法，能有效提高胚胎的發(fā)育潛能及胚胎的利用效率，而對新生兒未見明顯影響。關(guān)于縮短精卵孵育時(shí)間是否改善新生兒結(jié)局，其結(jié)論還需更大樣本量的研究來論證。

1Omu AE,Al-Azemi MK,Kehinde EO,et al.Indications of the mechanisms involved in improved sperm parameters by zinc therapy.Med Print Pract,2008,17:108-116.

2O WS,Chen H,Chow PH.Male genital tract antioxidant enzymes--their ability to preserve sperm DNA integrity.Mol Cell Endocrinol,2006,250:80-83.

3Bungum M,Humaidan P,Axmon A,et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome.Hum Reprod,2007,22:174-179.

4E S,Gardner DK,Schoolcraft WB,et a1.Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization.Fertil Steril,2004,82:378-383.

5Ahmadi A,Ng SC.Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.J Exp Zool,1999,284:696-704.

6Benchaib M,Braun V,Lomage J,et al.Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique.Hum Reprod,2003,18:1023-1028.

7張波,馮貴雪,周紅,等.降低體外受精-胚胎移植多胎妊娠的策略及效果分析.國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志,2012,31:399-403.

8方偉芬,馮貴雪,張波,等.精卵孵育時(shí)間對胚胎質(zhì)量的影響.廣西醫(yī)學(xué),2008,30:1333-1334.

9Kattera S,Chen C.Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates:a prospective,randomized,controlled study.Immunobiology,2003,80:1017-1021.

10Bungum M,Bungum L,Humaidan P.A prospective study,using sibling oocytes,examining the effect of 30 seconds versus 90 minutes gamete co-incubation in IVF.Hum Reprod,2006,21:518-523.

11Gianaroli L,Fiorentino A,Magli MC et al.Prolonged sperm-oocyte exposure and high sperm concentration affect human embryo viability and pregnancy rate.Hum Reprod,1996,11:2507-2511.

12Enkhmaa D,Kasai T,Hoshi K.Long-time exposure of mouse embryos to the sperm produces high levels of reactive oxygen species in culture medium and relates to poor embryo development.Reprod Domest Anim,2009,44:634-637.

13李娜,苗聰秀,向秋,等.短時(shí)受精在體外受精的臨床應(yīng)用.華夏醫(yī)學(xué),2011,24:247-249.

14屈宗銀,王鳳英,李玉艷,等．短時(shí)受精對體外受精結(jié)果的影響．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32:1785-1787.

15徐鴻毅,羅清炳,董毅飛,等.縮短精子孵育時(shí)間對體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響.湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2012,31:1-3.

16Barraud-Lange V,Sifer C,Pocate K,et al.Short gamete co-incubation during in vitro fertilization decreases the fertilization rate and does not improve embryo quality:a prospective auto controlled study.J Assist Reprod Genet,2008,25:305-310.

17王喜良,周敏,白雪,等．短時(shí)受精結(jié)合早期補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射在IVF-ET治療中的應(yīng)用.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19:103-104.

18張娜,張耀恒,張秩,等.長時(shí)受精過程中活性氧及精子的DNA損傷對體外受精結(jié)局的影響.中國男科學(xué)雜志,2013,27:8-12.