溫云花　葛菲　符愛(ài)貞　周冰

功能失調(diào)性子宮出血(dysfunctional uterine bleeding，DUB)是臨床上較為常見(jiàn)的婦科急癥，流行病學(xué)研究顯示，DUB的發(fā)病率呈現(xiàn)出了一定的上升趨勢(shì)，可達(dá)0.05%以上[1]。DUB導(dǎo)致的月經(jīng)量及月經(jīng)周期的紊亂，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制紊亂及下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)節(jié)異常，是促進(jìn)DUB發(fā)生、發(fā)展的主要因素。但近年來(lái)基礎(chǔ)研究顯示，子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境中的相關(guān)因子的改變，同樣可以加劇DUB患者的癥狀，促進(jìn)DUB的發(fā)生[2]。雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progestrogen，P)可以影響子宮內(nèi)膜的周期性改變，而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP-1)可以通過(guò)損傷子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮層，加劇DUB出血癥狀[3]。本研究選取2012年1月—2015年1月在本院婦產(chǎn)科診治的49例育齡期DUB患者，探討DUB育齡期婦女生殖激素水平、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)變化及意義，報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選取2012年1月—2015年1月在海口市婦幼保健院婦產(chǎn)科診治的育齡期DUB患者49例(DUB組)、月經(jīng)周期正常的健康女性20例(對(duì)照組)。DUB組年齡21～41歲，平均(29.8±5.1)歲；已婚32例，未婚17例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.1±1.8)kg/m2。對(duì)照組年齡21～41歲，平均(29.4±5.5)歲；已婚12例，未婚8例；月經(jīng)周期26～30 d，平均(28.2±1.2)d；BMI為(22.9±2.0)kg/m2。兩組年齡、婚姻狀況、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

納入標(biāo)準(zhǔn)為(1)DUB患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)DUB組3個(gè)月內(nèi)均未使用過(guò)激素、避孕藥物及避孕器具；(3)對(duì)照組為因男方因素導(dǎo)致不孕，準(zhǔn)備接受人工受精的婦女；(4)所有納入患者均為排卵性子宮出血；(5)本研究獲得研究對(duì)象的知情同意，并簽署保密協(xié)議。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月內(nèi)服用激素類(lèi)藥物、避孕類(lèi)藥物或使用避孕器械的患者；(2)患有全身系統(tǒng)性疾??；(3)患有生殖道感染性疾病；(4)患有生殖道腫瘤；(5)患有妊娠并發(fā)癥或異常妊娠；(6)有精神緊張、恐懼、憂傷、情緒不穩(wěn)定、焦慮、抑郁者。

2.免疫組化檢測(cè)方法:采用石蠟切片，切片厚度3 mm，室溫下用3% H2O2孵育5 min，應(yīng)用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 ml純水)封閉，室溫孵育5 min，加入MMP-9、TIMP-1抗體(鼠來(lái)源，南京碧云天生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔來(lái)源，購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入NBT/BCIP色劑顯色5 min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。

3.免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：MMP-9和TIMP-1陽(yáng)性著色主要表達(dá)于細(xì)胞漿、細(xì)胞核中，呈黃色、淡黃色、棕色、褐色顆粒表達(dá)；在高倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和觀察。(1)根據(jù)著色強(qiáng)度，0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例<10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4分，兩種積分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽(yáng)性。

3.血清中的E2及P標(biāo)本采集及檢測(cè)：清晨空腹采集靜脈血(診刮術(shù)術(shù)前24 h)，按照10 000 r/min的離心速度對(duì)血清進(jìn)行離心分離，-20 ℃保存待測(cè)，采集標(biāo)本后1周內(nèi)檢測(cè)E2、P，采用瑞士羅氏全自動(dòng)生化分析儀E170模塊進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海泰康生物科技有限公司。具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，試劑盒內(nèi)配有質(zhì)控血清或質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，所有操作嚴(yán)格按照操作說(shuō)明完成。

4.子宮內(nèi)膜組織中的E2及P標(biāo)本采集及檢測(cè)：診斷性刮宮過(guò)程中刮取的子宮內(nèi)膜組織，采用組織研磨法進(jìn)行研磨，加入細(xì)胞裂解液，采用去離子水作為陰性對(duì)照，采用50 μl cryab作為陽(yáng)性對(duì)照，平衡搖晃20 s混勻，室溫下孵育2 h，采用TBSP緩沖液清洗3次，每次5 min，加入100 μl底物，平衡搖晃30～45 s，25℃室溫下孵育40 min，加入250 μl終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后以空白對(duì)照為基準(zhǔn)，采用分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)E2、P。E2、P等抗體購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司，相關(guān)配套試劑購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作。

結(jié)果

1.兩組血清生殖激素水平比較：DUB組和對(duì)照組的血清E2、P水平比較，差異均無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　兩組血清生殖激素水平比較

2.兩組子宮內(nèi)膜E2、P表達(dá)水平比較：DUB組子宮內(nèi)膜中E2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，P表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2　兩組子宮內(nèi)膜E2、P表達(dá)水平比較值)

注：兩組比較，*P<0.05

3.兩組子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較：DUB組子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)中MMP-9表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，DUB組子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)中TIMP-1表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3，圖1、2。

表3　子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較分)

注：*P<0.05

4.DUB組子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1表達(dá)與子宮內(nèi)膜E2、P表達(dá)水平的關(guān)系：DUB組子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)中MMP-9與E2表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.411、0.502，P<0.05)，腺體和間質(zhì)中TIMP-1表達(dá)與E2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.368、-0.407，P<0.05)；DUB組子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)中MMP-9、TIMP1與子宮內(nèi)膜中P的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性。

討論

1.DUB的流行病學(xué)研究：性激素分泌紊亂、多次人工流產(chǎn)病史等，均可以促進(jìn)DUB的發(fā)生、發(fā)展，特別是在具有慢性盆腔炎癥性疾病病史的人群中，DUB的發(fā)病率更高，可較普通人群上升3～4倍[5]。臨床上DUB的長(zhǎng)期進(jìn)展可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜不典型增生等傾向惡性病變的發(fā)生，同時(shí)可以導(dǎo)致月經(jīng)量增多引起的嚴(yán)重貧血，危及生命。現(xiàn)階段，臨床上主要采用診斷性刮宮進(jìn)行DUB的診斷和治療，但刮宮聯(lián)合術(shù)后進(jìn)行雌孕激素治療的臨床總體有效率較低，不足45%[6-7]。而通過(guò)對(duì)DUB發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究，可以為DUB的治療提供理論依據(jù)，進(jìn)而提高其臨床治療效果。

2.E2及P的改變對(duì)于DUB的影響：子宮內(nèi)膜的增生期、分泌期過(guò)程中性激素水平的穩(wěn)定對(duì)于維持正常的月經(jīng)周期及月經(jīng)量具有重要的意義。E2可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生期持續(xù)性改變，而P可以在增生期改變的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)分泌期改變，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的正常脫落。有國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究認(rèn)為，DUB患者血清中或者子宮內(nèi)膜局部組織中的E2及P的表達(dá)紊亂，可以促進(jìn)DUB患者子宮內(nèi)膜異常脫落，進(jìn)而導(dǎo)致DUB患者發(fā)生反復(fù)出血[8]，但相關(guān)研究的樣本量較少，臨床資料的收集偏倚較為嚴(yán)重，可信度不高。

3.MMP-9及TIMP-1的改變與DUB的關(guān)系：MMP-9可以通過(guò)激活細(xì)胞間質(zhì)中的纖維蛋白分解酶原，進(jìn)而促進(jìn)膠原纖維的分解和代謝，并調(diào)控局部組織的炎癥損傷、細(xì)胞修復(fù)等，特別重要的是，MMP-9可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)成分的分解，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜血管的損傷，加劇內(nèi)膜出血；TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制物，在穩(wěn)定MMP-9活性的同時(shí)，還可避免過(guò)度激活MMP-9[9]。本研究的創(chuàng)新性在于探討了子宮內(nèi)膜局部組織中的TIMP-1及MMP-9等的表達(dá)，揭示了子宮內(nèi)膜局部微生態(tài)環(huán)境改變對(duì)于DUB的影響。

4.子宮內(nèi)膜局部組織中TIMP-1及MMP-9等指標(biāo)的變化分析：本研究發(fā)現(xiàn)，在DUB患者血清中并不存在明顯的E2及P的改變，DUB及正常對(duì)照人群的E2及P表達(dá)無(wú)差異，考慮雌激素或者孕激素上調(diào)導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜相關(guān)性激素受體的激活，并不會(huì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜的不規(guī)則脫落，不會(huì)引起異常子宮出血或者功能失調(diào)性出血的發(fā)生。通過(guò)對(duì)比分析子宮內(nèi)膜組織中E2及P的定量表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)，DUB患者局部子宮內(nèi)膜組織中的E2表達(dá)強(qiáng)度較高，而P的表達(dá)強(qiáng)度較低，E2的高表達(dá)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生期改變，而P表達(dá)的下降使得子宮內(nèi)膜的分泌期變化減弱，子宮內(nèi)膜的不同時(shí)期的變化失去了其原有的平衡。石曉敏等[10]和薛薇等[11]通過(guò)回顧性分析了39例DUB患者的臨床資料，采用蛋白定量檢測(cè)技術(shù)分析了E2及P的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E2可較正常女性上升25%以上，表達(dá)強(qiáng)度明顯上升，這與本研究的結(jié)論較為一致。免疫組化切片分析可見(jiàn)，MMP-9主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體的周邊，TIMP-1主要表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)中，特別是在血管周邊，MMP-9及TIMP-1的表達(dá)強(qiáng)度更高，提示二者的表達(dá)可能與影響子宮內(nèi)膜局部組織中的血管生理功能有關(guān)。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，MMP-9及TIMP-1的表達(dá)同樣呈現(xiàn)出了一高一低的趨勢(shì)，MMP-9的相對(duì)表達(dá)過(guò)多促進(jìn)內(nèi)膜血管的分解和破壞，促進(jìn)了子宮異常出血的發(fā)生，二者可能在促進(jìn)子宮內(nèi)膜剝脫或者增生性修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了一定的協(xié)同作用，但具體的機(jī)制仍然需要后續(xù)研究的進(jìn)一步證實(shí)。但需要注意的是，Shirota等[12]、Nouri等[13]和Jain等[14]并未發(fā)現(xiàn)DUB患者子宮內(nèi)膜組織中TIMP-1的表達(dá)下降，這與本研究的結(jié)論存在一定的差別，考慮認(rèn)為與樣本量的不足、檢測(cè)方法的不同等有關(guān)，這均可能導(dǎo)致研究結(jié)論的差別。

綜上所述，DUB患者子宮內(nèi)膜局部組織性激素表達(dá)的改變，以及MMP-9與TIMP-1平衡的打破，可能是促進(jìn)DUB發(fā)生、發(fā)展的重要因素。臨床上可以通過(guò)檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中的MMP-9等的表達(dá)變化，進(jìn)而為評(píng)估病情的遠(yuǎn)期預(yù)后提供一定的參考。本研究的局限性在于未能探討DUB患者治療轉(zhuǎn)歸過(guò)程中MMP-9等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，存在一定的不足。

(圖1、圖2見(jiàn)封三)

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12Shirota M,Kawashima J,Nakamura T,et al.Vascular hamartoma in the uterus of a female Sprague-Dawley rat with an episode of vaginal bleeding.Toxicol Pathol,2013,32:90-93.

13Nouri M,Tavakkolian A,Mousavi SR.Association of dysfunctional uterine bleeding with high body mass index and obesity as a main predisposing factor.Diabetes Metab Syndr,2014,8:1-2.

14Jain S,Vaid NB,Narang Y,et al.A Randomised Controlled Trial Comparing the Efficacy and Side-Effects of Intravaginal Ring (Nuvaring(?)) With Combined Oral Hormonal Preparation in Dysfunctional Uterine Bleeding.J Clin Diagnos Res,2016,10:21-23.