張曉威　王學(xué)舉　魏瑗　趙揚玉

成年疾病的胎兒起源假說和發(fā)育可塑性[1-3]已經(jīng)得到越來越多的流行病學(xué)調(diào)查及動物實驗研究結(jié)果的支持。在此基礎(chǔ)上，2003年學(xué)者們提出了健康和疾病的發(fā)育起源(developmental origins of health and disease, DOHaD)假說。DOHaD假說認(rèn)為，人類在早期發(fā)育過程(胎兒、嬰兒、兒童時期)經(jīng)歷胎盤功能不良、營養(yǎng)不良等不利因素，子代組織器官在結(jié)構(gòu)和功能上會發(fā)生永久性或程序性改變，將會影響成年后糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)精神疾病的發(fā)病風(fēng)險。

雖然單胎宮內(nèi)生長受限(intrauterine growth restriction, IUGR)與成年后的心血管疾病風(fēng)險[4]及包括肥胖、高血壓、2型糖尿病、血脂異常等在內(nèi)的代謝綜合征[5-6]已得到證實，但是在雙胎特殊并發(fā)癥——選擇性宮內(nèi)生長受限(selective intrauterine growth restriction, sIUGR)中卻鮮有研究。sIUGR是單絨毛膜性雙胎(monochorionic twins, MC)較為常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約為10%～15%[7]。其診斷尚未形成共識，目前廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)為，單絨毛膜性雙胎中任一胎兒超聲檢查估測體質(zhì)量小于相應(yīng)孕周的第10百分位，除外兩個胎兒均為小于胎齡兒(small for gestational age, SGA)。sIUGR胎兒圍生期發(fā)病率和死亡率較高[8]，嚴(yán)重影響圍產(chǎn)兒的健康。

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的新興組學(xué)技術(shù)，可對生物體內(nèi)所有代謝途徑的小分子產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，尋找生理、病理狀態(tài)下代謝產(chǎn)物和模式的改變。在婦產(chǎn)科學(xué)中，代謝組學(xué)還尚未大規(guī)模展開，但在婦科腫瘤、病理妊娠以及胎兒醫(yī)學(xué)相關(guān)方面已有初步應(yīng)用。在生長受限的不良宮內(nèi)環(huán)境中，這些紊亂可以導(dǎo)致生物代謝產(chǎn)物的含量、相對比例發(fā)生改變，而代謝組學(xué)的蓬勃發(fā)展為此提供了一個新的方法。MC雙胎來自同一受精卵，為在相似的遺傳背景下研究胎兒對于營養(yǎng)以及宮內(nèi)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)提供了獨特的視角。

本文基于氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF/MC)技術(shù)，研究sIUGR雙胎的臍血代謝輪廓，并利用多元變量統(tǒng)計分析和單變量統(tǒng)計分析篩選SGA胎兒與大胎兒的差異代謝物并加以鑒定，以尋找生長受限兒的代謝變化，并探索發(fā)生異常的相關(guān)代謝通路。

對象與方法

一、對象

選取2013年4月—2015年10月在北京大學(xué)第三醫(yī)院產(chǎn)科以剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的雙胎妊娠，分娩后檢查胎盤個數(shù)、羊膜囊個數(shù)和隔膜層數(shù)。嚴(yán)格篩選后，納入9例sIUGR進(jìn)行研究。研究組為sIUGR雙胎中生長受限(small for gestational age, SGA)胎兒，對照組為雙胎中生長正常的大胎兒(appropriate gestational age, AGA)。

單絨毛膜雙羊膜性(MCDA)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：妊娠6～9周，超聲檢查結(jié)果顯示宮內(nèi)僅見一個孕囊，囊內(nèi)可見2個胚芽；妊娠10～14周，雙胎間羊膜分隔與胎盤呈“T”征；分娩后經(jīng)組織學(xué)確認(rèn)。sIUGR診斷及分型：單絨毛膜性雙胎中，任一胎兒超聲檢查估測體質(zhì)量小于相應(yīng)孕周的第10百分位，除外兩個胎兒均為SGA。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙胎輸血綜合征(twin-to-twin transfusion syndrome, TTTS)、三胎以上妊娠、胎兒結(jié)構(gòu)或染色體異常、選擇性減胎術(shù)后、胎兒宮內(nèi)窘迫；嚴(yán)重母體并發(fā)癥如子癇前期、妊娠期糖尿病、高血壓疾病合并妊娠；代謝異常如甲狀腺及腎上腺疾病、高脂血癥等；絨毛膜羊膜炎；輔助生殖技術(shù)等。

二、方法

1.儀器和試劑：Agilent 7890氣相色譜儀，串聯(lián)LECO Pegasus 4D TOF/MS檢測器；低溫高速離心機(Thermo)等。所用甲醇(Merck, Lot：1772435515)及鹽酸甲氧胺(20 mg/mL，吡啶溶液，Supellco，Lot：LC01949V)均為色譜級，氯仿(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20131206)為分析純；核糖醇水溶液(>99%, 0.2 mg/mL, Fluca, Lot：12661714330b044)和TMCS購自Fluca，MSTFA (含1% TMCS，Lot: BCBN4262V)購自Aldrich，超純水為自制(18.2 Ω/cm)。

2.臍血采集與處理：胎兒娩出后斷臍，止血鉗夾閉近胎兒段臍帶，一次性無菌注射器抽取臍帶血5 ml，轉(zhuǎn)移至含EDTA抗凝管中，輕輕顛倒抗凝管，立即4℃下3 000 rpm離心10 min，分離血漿。-80 ℃凍存。標(biāo)本的采集已經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審議批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。

3.樣品前處理：于4 ℃解凍，取100 μl血漿樣品立即加500 μl甲醇，充分渦旋混合后加入10 μl 0.2 mg/ml核糖醇水溶液作為內(nèi)標(biāo)。混合溶液在70 ℃水浴中震搖15 min后放置室溫下冷卻，13 000轉(zhuǎn)離心后取上清液加入450 μl去離子水和270 μl氯仿萃取，經(jīng)過萃取后將極性相氮氣吹干，并由含1% TMCS的MSTFA完成衍生化后，取0.3 μl樣品進(jìn)行儀器分析。

4. 分析條件：采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC-TOF/MC)技術(shù)分析sIUGR生長受限兒和正常大胎兒血漿代謝圖譜。(1)色譜條件：Gerstel MPS進(jìn)樣系統(tǒng)；Agilent色譜柱DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 mm。程序升溫：70 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。載氣：氦氣；流速：1 ml/min；進(jìn)樣體積：1 μl；不分流進(jìn)樣。(2)質(zhì)譜條件：EI源：70 eV；溶劑延遲：330 s；質(zhì)量掃描范圍：50～800 Da；采集電壓：1600 V；采集速度：10 Spectra/second；進(jìn)樣口、傳輸線和離子源溫度分別為：250 ℃、250 ℃及220 ℃。

5.數(shù)據(jù)處理:采用Agilent色譜工作站軟件自動識別噪比大于100的色譜峰。經(jīng)對齊、去卷積、峰查找等處理后，得到包含保留時間及峰面積的數(shù)據(jù)集，得到代謝物總離子流色譜圖(total ion chromatogram, TIC)。利用NIST02數(shù)據(jù)庫檢索鑒定質(zhì)譜數(shù)據(jù)。過濾原始數(shù)據(jù)，挑選共有峰利用內(nèi)標(biāo)法處理，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 10.0(UmetricsAB, Umea, Sweden)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘-判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)。PCA是一種典型的無監(jiān)督模式識別方法，可直觀反映樣品間的差異和距離；而PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，可以尋找與分組密切相關(guān)的標(biāo)志。自動建模分析后，結(jié)果以得分圖形式表示，判斷生長受限組與正常組的樣品差異性。用第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP)表示不同代謝物對PLS-DA模型的貢獻(xiàn)，VIP值大于1的變量表示該物質(zhì)對模型貢獻(xiàn)高于平均水平，是區(qū)分兩組的潛在標(biāo)記物。篩選VIP值>1的代謝物，為驗證篩選出的候選差異代謝物是否有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究使用KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)查詢差異代謝物信息。

結(jié)　　果

一、一般情況

9例sIUGR孕婦，平均年齡(27.56±2.70)歲；孕周31+2～35+3周，平均孕周(33.0±1.3)周；SGA與大胎兒的出生體重分別為(1 093.33±363.73)g、(2 021.11±244.51)g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；身長分別為(36.94±5.23)cm、(43.56±2.46)cm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、GC-TOF/MS檢測結(jié)果

sIUGR雙胎臍血血漿經(jīng)處理分析后，典型總離子流色譜圖(total ion chromatorgraphy, TIC)如圖1。TIC圖中每個色譜峰代表一種流出峰，可見，生長受限組樣本2(圖1B)與正常組樣本2(圖1A)的臍血代謝物譜峰存在一定差異。詳細(xì)情況還需要進(jìn)一步分析。

A.為sIUGR 中正常胎兒一個臍血血漿樣本的典型TIC圖；B.為sIUGR生長受限兒一個臍血血漿樣本的典型TIC圖。縱坐標(biāo)為離子強度，橫坐標(biāo)為掃描的保留時間，TIC圖中每個峰代表了一種流出峰，從該圖可以看出，A與B存在一定差異 圖1　GC-TOF/MS測定兩組臍血血漿代謝物典型總離子流色譜圖

三、代謝物PCA及PLS-DA分析結(jié)果

原始數(shù)據(jù)經(jīng)對齊、去卷積、峰查找等處理后匹配后，得到包含保留時間及峰面積的18樣品×751峰數(shù)的數(shù)據(jù)集，過濾數(shù)據(jù)并模擬缺失值，利用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化處理后，得到18樣品×617個變量。

使用SIMCA軟件建模進(jìn)行PCA分析，數(shù)據(jù)降維后得到8個主成分，模型參數(shù)R2X為0.917，說明建立的模型符合數(shù)據(jù)的真實情況。繪制PCA得分圖如圖2A所示。圖中每一個點代表一個樣品，各樣品在第一主成分(t[1])與第二主成分(t[2])構(gòu)成的平面上的投影得分圖可直觀反應(yīng)樣品間的相似或差異，數(shù)據(jù)點間的距離越小說明所代表的樣品的含有的代謝物組成和濃度越接近；反之，其差異越大[11]。PCA得分圖顯示該模型不能有效區(qū)分兩組樣品的差異，進(jìn)而采用有監(jiān)督的PLS-DA進(jìn)行分析。PLS-DA得分圖如圖2B所示。從中可以看到，兩組樣品在第二主成分(t[2])上可較好的分離，可見SGA與對照組(大胎兒)血漿代謝差異區(qū)分較明顯。PLS-DA模型的參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別是0.259、0.848和-0.0486。由于樣本量較小，變量數(shù)遠(yuǎn)大于樣品數(shù)，所以雖然該模型能較好的解釋數(shù)據(jù)的情況，但Q2說明原模型存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性一般，預(yù)測能力較差。

A.為生長受限組對大胎兒組(對照組)的PCA得分圖；B.為生長受限組對大胎兒組(對照組)PLS-DA得分圖。得分圖中每個數(shù)據(jù)點代表一個樣品，其中，■代表對照組，○代表生長受限組。數(shù)據(jù)點間的距離越小說明所代表的樣品之間的代謝物組成越相似；反之，差異則越大。橫坐標(biāo)t[1]表示第一主成分，縱坐標(biāo)t[2]表示第二主成分，圖B可以看到生長受限組與對照組在第二主成分上可較好的分離 圖2　生長受限組和大胎兒組(對照組)的PCA及PLS-DA得分圖

四、差異代謝物鑒定及分析

為了確認(rèn)生長受限組與對照組出現(xiàn)圖2B差異的變量，選擇PLS-DA模型中的變量投影重要度(VIP)值大于1的變量51個，鑒定后得到39種作為潛在的差異代謝物質(zhì)，經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗顯著性檢驗，最終篩選出10種有統(tǒng)計學(xué)差異的代謝物(見表1)。

這些代謝物形成復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致了sIUGR生長受限胎兒臍血代謝組的差異。搜索KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)，查詢差異代謝物，并映射到數(shù)據(jù)庫已有的代謝通路，最終發(fā)現(xiàn)sIUGR生長受限兒相較于正常胎兒發(fā)生改變的代謝通路主要集中于碳水化合物、氨基酸及脂代謝等，部分差異代謝物映射的代謝通路整理見表2。

表1　生長受限兒和大胎兒臍血血漿差異代謝物

注：保留時間為該化合物達(dá)到流出濃度峰值的時間，VIP值為該物質(zhì)對PLS-DA模型的貢獻(xiàn)程度。數(shù)據(jù)保留3位有效數(shù)字，采用Wilcoxon符號秩檢驗，*P<0.05，**P<0.01；下調(diào)表示該代謝物臍血水平在生長受限兒中低于大胎兒

表2　 sIUGR雙胎差異代謝物映射的部分代謝通路

討　　論

目前認(rèn)為sIUGR的發(fā)病與胎盤分隔不均及不同類型的胎盤吻合血管存在[12]相關(guān)，但具體機制目前仍不清楚，而代謝組學(xué)是研究生物體受外部刺激或遺傳修飾后，細(xì)胞或組織產(chǎn)生的代謝應(yīng)答變化的科學(xué)[13]，可以為探討sIUGR病因提供了新的研究思路。本研究基于GC-TOF/MS的代謝組學(xué)方法，通過檢測反映胎兒宮內(nèi)生理功能代謝情況的臍血，探討sIUGR雙胎的代謝變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sIUGR雙胎中生長受限胎兒相較于正常胎兒代謝輪廓不同，在SGA胎兒中，代謝水平增加的代謝產(chǎn)物包括山梨醇、肌醇、甘氨酸、吡啶甲酸，降低的代謝物有亮氨酸、纈氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、膽固醇和肌酸。部分結(jié)果與單胎IUGR的報道類似[14-19]。

氨基酸代謝方面，在生長受限兒組代謝水平下調(diào)的亮氨酸和纈氨酸屬于支鏈氨基酸(BCAA)，BCAA在刺激蛋白質(zhì)合成和抑制骨骼肌中蛋白質(zhì)的降解起主要作用[20]，并可增強真核細(xì)胞翻譯起始因子的合成、參與mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的活性[21]，以促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)；甘氨酸參與了蛋白質(zhì)和與許多重要的代謝相關(guān)分子的合成，對缺血再灌注損傷等病理損傷也具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)[22]作用。這里對于甘氨酸的變化水平不同的研究有一定的分歧，Bajoria等[23]對sIUGR胎兒血漿氨基酸水平直接進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)受限兒血漿甘氨酸濃度較AGA低，而另外幾項質(zhì)譜研究[15，24]則發(fā)現(xiàn)甘氨酸水平在IUGR胎兒血漿和尿液中上調(diào)，本研究結(jié)論支持上調(diào)。鑒于不同研究的樣本量、研究方法等差異，小分子代謝物的變化水平確實有著相反的報道，如Cosmi等發(fā)現(xiàn)色氨酸在FGR胎兒下調(diào)[25]，而在另一下研究中則上調(diào)[24]。雖然甘氨酸水平的上調(diào)可以解釋生長受限兒在氨基酸代謝方面出現(xiàn)了異常，并提示在炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對于sIUGR的發(fā)生發(fā)展有一定的作用，但對于這一矛盾的結(jié)論，我們認(rèn)為還需要后期大樣本的驗證。以游離和磷酸化形式存在體細(xì)胞內(nèi)的肌酸[26]除了參與氨基酸代謝，也與ATP的生成相關(guān)，肌酸水平的增加可能由增強的氧化代謝及高滲狀態(tài)引起，并可能與成年后腎衰竭發(fā)生率的增加[15]相關(guān)。

脂代謝方面，棕櫚酸(PA)可引起胰島素抵抗、線粒體功能障礙[27]，與非妊娠狀態(tài)的肥胖相關(guān)疾病相關(guān)[28]。此外，PA還是腦細(xì)胞膜和髓磷脂片的必要部分[29]，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用；膽固醇水平降低與單胎IUGR的文獻(xiàn)報道一致[19]，其異常脂質(zhì)代謝可能是因為低氧損傷誘導(dǎo)血漿脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致高脂血癥及高膽固醇[30]。

在碳水化合物代謝方面，山梨醇是糖代謝的中間產(chǎn)物，糖尿病或半乳糖血癥患者山梨醇水平增加[31-32]，并能影響組織對肌醇的吸收，共同參與半乳糖代謝；肌醇是一類環(huán)狀糖醇，在真核細(xì)胞中作為第二信使的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[33]，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。肌醇代謝異常與與成年后糖耐量低減、胰島素抵抗和糖尿病的長期微血管并發(fā)癥相關(guān)[34-35]，研究中肌醇水平的增高可能由生長受限兒的高胰島素水平[15]引起。

這些代謝反應(yīng)并不單獨進(jìn)行，其相互調(diào)控形成一個巨大的代謝網(wǎng)絡(luò)，最終構(gòu)成了sIUGR雙胎的代謝組差異。總之，本研究采用同卵雙胎作為研究對象，較好的去除了外界環(huán)境、遺傳背景以及母體因素等混雜因素的干擾，有利于展開復(fù)雜性雙胎的病因研究，并建立了sIUGR臍血代謝組的分析模型，發(fā)現(xiàn)了部分差異代謝標(biāo)志物，為后期臨床干預(yù)提供一定的思路。先前已有若干關(guān)于單胎或雙胎生長受限兒營養(yǎng)補充的研究，例如給予胎兒高能量飲食喂養(yǎng)[36]或?qū)m內(nèi)補充氨基酸[37]，代謝水平及生長發(fā)育都得到了一定的改善。我們期望通過sIUGR代謝組學(xué)的研究，可增強人們對于營養(yǎng)和生活方式在健康和疾病管理作用的認(rèn)識，在宮內(nèi)及分娩后針對代謝通路進(jìn)行有效的臨床干預(yù)，進(jìn)而預(yù)防遠(yuǎn)期代謝疾病的發(fā)生。然而本研究也存在一定的不足，由于對sIUGR胎兒和母體的嚴(yán)格篩選，樣本量較小，得到的差異代謝物可能會有偏差，這需要后期進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行更加深入的研究與驗證。

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