張亮亮，蔡立婭，魏啟美，江陸斌，梁韶暉

（1.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 寄生蟲學教研室，浙江 溫州 325035；2.中科院上海巴斯德研究所分子病毒學和免疫學重點實驗室，上海 200031）

惡性瘧原蟲組蛋白甲基轉移酶SET7催化結構域的表達及活性鑒定

張亮亮1，蔡立婭1，魏啟美1，江陸斌2，梁韶暉1

（1.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 寄生蟲學教研室，浙江 溫州 325035；2.中科院上海巴斯德研究所分子病毒學和免疫學重點實驗室，上海 200031）

目的:構建桿狀病毒昆蟲表達質粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd和無細胞麥胚表達載體pEUHis-set7cd，表達惡性瘧原蟲組蛋白甲基轉移酶SET7催化結構域（PfSET7cd），并鑒定PfSET7cd的組蛋白甲基轉移酶活性。方法:通過分子克隆技術構建獲得pFast-N/C-set7cd以及pEU-His-set7cd表達質粒，嘗試通過桿狀病毒傳代方式與無細胞麥胚表達方式獲得重組PfSET7cd蛋白，以SDS-PAGE和Western blot鑒定表達產物，并進一步檢測重組蛋白的酶活性。結果:用于昆蟲表達的重組質粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd雙酶切結果大小與測序結果均正確，但是Western blot并未檢測到其在昆蟲細胞中的可溶性表達產物；pEU-His-set7cd通過無細胞麥胚表達系統(tǒng)表達獲得的蛋白與預測大小一致，經(jīng)Western blot鑒定正確，并用NTA-Ni2+親和層析純化。體外酶活實驗顯示PfSET7cd具有催化H3第36位賴氨酸上三甲基化（H3K36me3）活性。結論:通過無細胞表達系統(tǒng)獲得可溶性的PfSET7cd重組蛋白，PfSET7cd重組蛋白具有介導H3K36me3的活性，但不影響H3K4me3和H3K9me3水平。

惡性瘧原蟲；組蛋白甲基轉移酶；重組蛋白表達；無細胞麥胚表達系統(tǒng)；活性鑒定

瘧疾為世界上三大傳染病之一，嚴重危害著人類的健康。最新統(tǒng)計顯示全球每年約有2億人感染瘧疾，死亡人數(shù)達到60萬之多[1]，了解瘧原蟲致病機制顯得尤為重要。惡性瘧原蟲感染過程中，毒力基因家族（var家族、rif家族和stevor家族）與致病密切相關[2-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白表觀遺傳學修飾在調控惡性瘧原蟲毒力基因表達的過程中發(fā)揮著非常重要的作用，組蛋白表觀遺傳學修飾控制著毒力基因家族的激活、沉默以及選擇性表達，并和紅內期裂殖子侵染以及耐藥性產生[5]有關。但直到目前為止對瘧原蟲組蛋白修飾酶的研究并不多，尤其是參與組蛋白甲基化修飾的組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase，HMTs）。研究HMTs不僅可以從生化水平明確蛋白質的活性功能，同時能深刻理解該類HMTs在惡性瘧原蟲感染致病過程中所扮演的角色，更為以后進一步預防和治療瘧疾提供理論基礎和相應的潛在藥物靶點。

CUI等[6]通過生物信息學分析，將惡性瘧原蟲Pf11_0160基因的產物注釋為SET7。在人類細胞中，SET7/9主要控制組蛋白H3K4甲基化，能廣泛調節(jié)多種類型基因的激活[7]。因此，作為一個潛在的轉錄激活候選因子，我們嘗試研究該惡性瘧原蟲組蛋白甲基轉移酶SET7（Plasmodium falciparum histone-lysine N-methyltransferase SET7，PfSET7）的組蛋白修飾功能，為后續(xù)研究其在惡性瘧原蟲基因尤其是毒力基因和抗藥基因表達調控中的作用提供理論基礎。

本研究通過序列分析獲得PfSET7催化結構域（PfSET7 catalytic domain，PfSET7cd）編碼序列，分別使用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)和無細胞麥胚表達系統(tǒng)來表達PfSET7cd，并對表達獲得的重組PfSET7cd蛋白的酶學性質和功能進行了初步的分析研究，為進一步了解PfSET7的功能及針對PfSET7進行相關藥物的研制奠定了一定的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體與菌種:惡性瘧原蟲Plasmodium falciparum 3D7，pFast-Bac-N/C、pEU-His載體為本實驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、感受態(tài)DH10Bac購自南京諾唯贊生物有限公司；昆蟲細胞Sf9為本實驗室保存；引物和基因測序由上海生物工程有限公司完成，Snakeskin透析袋購自美國Pierce公司。

1.1.2 主要試劑:限制性內切酶購自美國Thermo scientific；In-fusion無縫連接試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司；質粒小抽中抽試劑盒、膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司；昆蟲培養(yǎng)基Sf-900TMII SFM（1×）購自美國Gibco公司；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；組氨酸標簽抗體購自南京EnoGene公司，辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗鼠二抗購自上海聯(lián)科生物技術公司。麥胚無細胞蛋白表達試劑盒WEPRO 7240H購自北京天根生化有限公司；組蛋白甲基化H3K4me3抗體、H3K9me3抗體和H3K36me3抗體購自美國Abcam公司；牛胸腺組蛋白提取物購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 pFast-N/C-set7cd和pEU-his-set7cd質粒的構建:惡性瘧原蟲P.falciparum 3D7按照文獻[8]方法進行培養(yǎng)并提取基因組。引物序列見表1。PCR擴增PfSET7基因PF11_0160中的SET結構域片段（260 aa-654 aa），基因序列大小為1 185 bp，PCR反應條件為:94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；60 ℃ 60 s；60 ℃ 7 min；30個循環(huán)。利用Infusion無縫連接方式將目的序列插入到對應的載體中，線性化載體時pFast-Bac-N限制性酶切位點為Sal I/Hind I I I、pFast-Bac-C限制性酶切位點為EcoR I/Xho I、pEU-His載體限制性酶切位點為Xho I/Not I。pFast-N-set7cd與pFast-C-set7cd質粒的SUMO-His標簽分別位于pFast-Bac載體多克隆位點目的序列的N端和C端，可與插入片段融合表達。

1.2.2 昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達:將測序正確的質粒pFast-N/C-set7cd分別轉化至感受態(tài)DH10Bac中，通過藍白斑篩選48 h后挑取陽性單克隆菌37 ℃培養(yǎng)24 h后提取桿狀病毒基因組，通用引物M13F/R進行PCR鑒定。PCR鑒定反應條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 1.5 min；72 ℃ 6 min；30個循環(huán)。用脂質體方式將鑒定正確的桿狀病毒基因組轉染到昆蟲細胞Sf9中。轉染用的昆蟲Sf9細胞密度控制在1×106～2×106之間，具體的轉染、培養(yǎng)與蛋白表達步驟參照美國Invitrogen公司Bac-to-Bac TOPO Expression system操作手冊，病毒傳代第三代時（12 d）檢測蛋白。

1.2.3 無細胞麥胚系統(tǒng)表達PfSET7cd:將測序正確的質粒pEU-His-set7cd轉化培養(yǎng)提取質粒進行體外轉錄后翻譯。轉錄條件為PCR儀中37 ℃孵育6 h。轉錄的mRNA在6孔板中進行翻譯，15 ℃，孵育20 h。其中小量反應和大量反應所用質粒量為1 μg和4 μg，反應體系和具體步驟參照試劑盒WERPR 7240H使用說明。

表1 PCR引物序列信息

1.2.4 重組蛋白檢測:轉染后的昆蟲細胞Sf9進行病毒傳代培養(yǎng)表達目的蛋白，將12 d時收集的樣品分為培養(yǎng)基、細胞超聲裂解后的上清、沉淀；無細胞麥胚表達系統(tǒng)表達產物經(jīng)離心分為上清和沉淀。2種表達體系得到的各樣品分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）和考馬斯亮藍染色，分析目的蛋白的表達。另將得到的各樣品進行Western blot鑒定，一抗為鼠源性抗His單抗（1∶2 000稀釋），二抗為山羊抗鼠抗體（1∶5 000稀釋）。

1.2.5 PfSET7cd蛋白濃縮與純化:麥胚無細胞表達的產物經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心15 min后收集上清，將收集的上清置于透析袋4℃透析過夜（透析緩沖液:500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9）。透析后上清使用NTA-Ni2+親和層析法進行純化[9]并用10% SDS-PAGE鑒定，鑒定后的PfSET7cd蛋白用含有20%甘油的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）4 ℃過夜透析，濃縮后-20 ℃保存。

1.2.6 PfSET7cd體外酶活鑒定:取純化后PfSET7cd蛋白1 μg與底物組蛋白2 μg在緩沖液中（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，10%甘油，20 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，S-腺苷甲硫氨酸）充分混勻，30 ℃孵育4 h，陰性對照用反應緩沖代替PfSET7cd蛋白。此外，我們用人源的H3K9me2的甲基轉移酶G9a作為檢測體系的陽性對照，其使用量及反應條件與PfSET7cd一致。反應結束后用15% SDS-PAGE膠進行Western blot鑒定組蛋白底物中H3K4me3、H3K9me3和H3K36me3的變化，一抗為Abcam公司對應的甲基化抗體（1∶2 000稀釋），二抗為山羊抗兔抗體（1∶10 000稀釋）。

2 結果

2.1 pFast-N/C-set7cd、pEU-His-set7cd質粒的構建以及重組病毒基因組的鑒定 構建的質粒pFast-N-set7cd和pFast-C-set7cd分別用Sal I/Hind I I I、EcoR I/Xho I雙酶切和測序鑒定構建成功（見圖1A）。將成功構建的pFast-N/C-set7cd質粒轉化至大腸桿菌DH10Bac中，挑取單克隆菌經(jīng)培養(yǎng)提取重組桿狀病毒基因組，PCR鑒定大小為3 625 bp（見圖1B）。對構建好的質粒pEU-His-set7cd進行PCR鑒定，結果為1 185 bp，與目的序列大小一致（見圖1C），測序結果正確。

圖1 PfSET7cd重組質粒構建

2.2 重組蛋白表達純化與鑒定 SDS-PAGE考馬斯亮藍染色和Western blot鑒定顯示set7cd在昆蟲表達系統(tǒng)并沒有獲得可溶性蛋白，目的蛋白僅出現(xiàn)在細胞裂解后的沉淀中，即蛋白以包涵體的形式表達，并且表達量低，考馬斯亮藍染色無法檢測。而無細胞麥胚表達系統(tǒng)得到了預期的目的蛋白，SDS-PAGE考馬斯亮藍染色顯示，實驗組在50 kDa處有一條明顯的條帶（見圖2A），與預測大小一致；Westernblot結果顯示，同一位置的條帶具有組氨酸標簽（見圖2B），經(jīng)過NTA-Ni2+親和層析純化得到PfSET7cd（見圖2C），因此我們通過無細胞麥胚表達方式成功獲得融合了組氨酸標簽的可溶性PfSET7cd。

圖2 PfSET7cd蛋白表達與鑒定

2.3 PfSET7cd蛋白體外酶活鑒定 根據(jù)甲基化修飾的賴氨酸位點不同，可以激活基因的轉錄亦可以抑制基因轉錄。我們選取并檢測了惡性瘧原蟲組蛋白H3常見的3個甲基化修飾位點（H3K4、H3K9和H3K36）的三甲基化變化。用對應的抗體進行Western blot檢測，結果顯示PfSET7cd并沒有改變H3K4和H3K9的三甲基化水平，但是H3K36三甲基化水平明顯升高，這表明PfSET7cd蛋白具有催化H3K36三甲基化形成的能力，見圖3。

圖3 PfSET7cd蛋白體外酶活鑒定

3 討論

目前，瘧疾在許多國家依然是一個重大的公共衛(wèi)生負擔，伴隨著瘧原蟲抗藥性的發(fā)生和擴散日趨嚴峻[10-11]，人類需要更深刻了解瘧原蟲的致病和抗藥性產生機制來研制針對性的疫苗或藥物，而對瘧原蟲基因功能的注釋是最基礎的工作[12]。體外對蛋白功能活性進行研究可以避免瘧原蟲復雜內環(huán)境的干擾，有助于獲得清晰明確的結論，利用成熟的蛋白表達系統(tǒng)獲得具有活性的可溶性蛋白則是重要前提。不同于常見的模式物種，惡性瘧原蟲來源的蛋白在異源表達時普遍存在表達量低以及表達產物不溶的特點[13]。一方面是該物種的基因組成中AT含量高達80%[14-15]，密碼子偏好AT，如AGA/AGG（R），AUA（I），GGA（G）[16]。文獻[16]報道，優(yōu)化E.coli的tRNA組成可以顯著提高惡性瘧原蟲DHPS基因的表達。常見的幾種表達系統(tǒng)（大腸桿菌、酵母以及哺乳動物）都沒有專門針對高AT編碼基因進行過優(yōu)化，因此容易導致低水平表達的現(xiàn)象發(fā)生。另一方面Plasmodium falciparum中的蛋白存在大量單氨基酸及多氨基酸的重復序列，因此在翻譯過程中，需要一些特定的輔助因子幫助折疊才能形成正確的構象[17]，而異源表達的過程中缺乏相關輔助因子，所以極易導致蛋白聚集形成不溶沉淀[18]。

昆蟲表達系統(tǒng)具有大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工能力，是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)。我們嘗試在蛋白的N端或C端融合了SUMO標簽以促進產物可溶性，但只有極少量不溶性產物存在于細胞沉淀中。我們懷疑不溶產物是因為缺少必要的折疊輔助因子導致蛋白大量聚集。

本研究中，我們進一步嘗試了無細胞麥胚表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有快速、高通量的優(yōu)點，并且不需要密碼子優(yōu)化[19-21]。RUI等[22]專門比較過原核表達系統(tǒng)和麥胚無細胞表達系統(tǒng)在惡性瘧原蟲蛋白表達上的特點，發(fā)現(xiàn)麥胚無細胞表達系統(tǒng)更容易獲得大量的可溶性蛋白產物。本研究分別用無細胞麥胚表達系統(tǒng)和昆蟲細胞表達系統(tǒng)來表達重組PfSET7cd，發(fā)現(xiàn)無細胞麥胚表達系統(tǒng)的重組PfSET7cd表達量明顯提高，并且都以可溶形式存在，明顯優(yōu)于昆蟲細胞表達系統(tǒng)。

CUI等[6]將Plasmodium falciparum的PfSET7歸類到SET7家族。已有報道顯示人的SET7/9（Hs-SET7/9）主要負責H3K4的甲基化[23]。由于PfSET7和HsSET7/9同源性僅為12.8%，故二者在底物特異性上可能會有所差別。因此在活性檢測時，我們同時檢測了組蛋白H3的K4、K9和K36位的甲基化修飾。而本研究的結果也顯示，PfSET7cd并不能催化H3K4和H3K9的甲基化，而對H3K36三甲基化具有較高活性。

當前已知的在哺乳動物中可催化H3K36發(fā)生甲基化的酶有SET2和NSD1[23]，而H3K36甲基化修飾多存在于轉錄活化基因的編碼區(qū)，主要影響基因轉錄的激活過程[24]，與染色體激活區(qū)域有關。而在惡性瘧原蟲中，H3K36甲基化與毒力基因家族的激活有著密切的聯(lián)系[5]，提示PfSET7有可能參與到毒力基因家族的表達調控中。這為進一步研究PfSET7的生物學功能，探索惡性瘧原蟲表觀遺傳及針對PfSET7相關藥物抑制劑的研制奠定了一定的基礎。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression and activity identif cation of Plasmodium falciparum histone H3 methyltransferase SET7 cata-

lytic domain

ZHANG Liangliang1, CAI Liya1, WEI Qimei1, JIANG Lubin2, LIANG Shaohui1. 1.Department

of Parasitology, School of Basic Medical Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institute Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200031

Objective：To construct the recombinant baculovirus expression plasmid pFast-N-set7cd, pFast-C-set7cd and cell-free wheat germ expression vector pEU-His-set7cd, to express Plasmodium falciparum histonelysine N-methyltransferase SET7 catalytic domain (PfSET7cd), and to identify PfSET7cd protein methyltransferase activity.Methods：pFast-N/C-set7cd and pEU-His-set7cd were constructed for expression of recombinant PfSET7cd by baculovirus-insect cell system and wheat germ cell-free expression system, respectively, and recombinant protein was identif ed by SDS-PAGE and Western blotting. Furthermore, recombinant protein was purif ed and applied in vitro enzymatic activity assay.Results：The recombinant plasmid pFast-N-set7cd and pFast-C-set7cd were constructed successfully and conformed by sequencing. However, no soluble PfSET7cd protein was detected by Western blotting in insect cells. By wheat germ cell-free expression system, soluble recombinant PfSET7cd was expressed and the molecular weight of protein agreed well with the theoretical prediction, which was identif ed by Western blot. And then, recombinant PfSET7cd was purif ed with NTA-Ni2+aff nity column. In vitro enzymatic activity assay showed that PfSET7cd exhibites H3K36me3 activity.Conclusion：Soluble recombinant protein, PfSET7cd, can be successfully obtained by wheat germ cell-free expression system, and this protein can catalyze H3K36 trimethylation (H3K36me3) in vitro while has no effects on the H3K4 trimethylation (H3K4me3) or H3K9 trimethylation (H3K9me3).

Plasmodium falciparum; histone-lysine N-methyltransferase; recombinant protein expression; wheat germ cell-free expression system; activity identif cation

R382.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.006

2016-07-01

浙江省科技廳公益技術研究社會發(fā)展項目（2015C33101）；浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（2014R 413079）；溫州市公益科技項目（Y20140481）。

張亮亮（1989-），男，山西長治人，碩士生。

梁韶暉，教授，碩士生導師，Email:lsh@wmu.edu.cn。