田杰，張志安，孫國興，肖保增，張文超，楊繼濤，張慶永，尹曉，耿國旺

（清河縣人民醫(yī)院 普外科，河北 邢臺 054899）

二肽酶IV在胃癌中的表達及臨床意義

田杰，張志安，孫國興，肖保增，張文超，楊繼濤，張慶永，尹曉，耿國旺

（清河縣人民醫(yī)院 普外科，河北 邢臺 054899）

目的:檢測二肽酶IV（DPP IV）在胃癌組織中的表達，探討其在胃癌預(yù)后中的價值。方法:收集本院手術(shù)后的胃癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織112例，用免疫組織化學(xué)方法定性比較胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中DPP IV的表達；Western blot定量比較胃癌組織及癌旁正常組織中DPP IV蛋白的表達。結(jié)果:免疫組織化學(xué)結(jié)果示DPP IV在癌旁正常組織中有3例（占2.7%）表達缺失；胃癌組織中有78例（占69.6%）表達缺失；Western blot結(jié)果示DPP IV在胃癌組織中的含量明顯低于癌旁正常組織；多因素分析示DPP IV是胃癌不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子（P＜0.001）。結(jié)論:DPP IV表達缺失是胃癌不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子。

二肽酶IV；胃腫癌；病理學(xué)；預(yù)后

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2003年1月至2014年12月在我院普外科行手術(shù)治療的胃腺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織112例，術(shù)前未經(jīng)過放療及化療。納入標準∶入選病例均為原發(fā)性胃管狀腺癌根治標本。排除標準:胃鱗狀細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌及腺癌活檢標本。記錄腫瘤部位、大小、組織學(xué)分級、浸潤深度及淋巴結(jié)和遠處器官轉(zhuǎn)移情況。所有胃腺癌標本均有完整的病理資料及隨訪資料，隨訪時間為手術(shù)日至死亡或末次隨訪日，所有死亡均與癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。DDP IV單克隆抗體購自丹麥DaKo生物試劑公司，相應(yīng)二抗EnVision試劑盒購自北京博奧生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色:所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后HE染色，經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師采取雙盲法對112例胃腺癌組織切片進行復(fù)診及組織學(xué)分級確認。冰凍切片機5 μm厚連續(xù)切片制成冰凍切片。免疫組織化學(xué)染色操作嚴格按照試劑盒說明書進行，用正常大腸組織切片作陽性對照，PBS替代一抗作陰性對照，切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽加熱抗原修復(fù)，然后采用EnVision兩步法進行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判定:DDP IV染色以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，采用半定量積分法判斷結(jié)果。根據(jù)染色強度評分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細胞數(shù)所占百分比評分:＜10%為0分，11%～50%為1分，51%～75%為2分，＞76%為3分。兩項得分相乘，0～3分記為（-），4～5分記為（+），6～8分記為（++），≥9分記為（+++）。染色結(jié)果為陰性者，認為DDP IV表達缺失。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取及Western blot分析:經(jīng)液氮超低溫保存的112例胃癌及癌旁正常組織用于提取蛋白質(zhì)以進行Western blot分析。用放射免疫沉淀裂解液提取胃癌組織塊中的總蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度以判斷標本是否合格，取100 μg樣品上清液，聚丙烯酰胺凝膠電泳。4 ℃、100 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜過夜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入DDP IV及β-actin（1∶400稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加適量辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，于37 ℃孵育2 h，然后在暗室中顯影，底片經(jīng)掃描儀透掃后用凝膠分析軟件Image Pro Plus對電泳結(jié)果進行灰階分析，以DDP IV與β-actin 的光密度比值表示其相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以χ2檢驗DDP IV的表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的相互關(guān)系；DDP IV在胃癌預(yù)后中的價值使用多因素Cox分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPP4在胃癌中表達的免疫組織化學(xué)分析 DDP IV在癌旁組織中有3例（占2.7%）表達缺失，在胃癌組織中有78例（占69.6%）表達缺失（見圖1）。DDP IV蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系見表1，DDP IV的表達缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM臨床分期相關(guān)（P＜0.05）。伴有淋巴結(jié)及肺轉(zhuǎn)移者DDP IV的表達缺失的頻率增高，胃癌浸潤更深及TNM分期更晚者DDP IV的表達缺失的概率更大。

圖1 免疫組織化學(xué)結(jié)果示DDP IV的表達

表1 DPP IV表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（例）

2.2 DDP IV在胃癌中表達的Western blot分析

Western blot結(jié)果顯示，癌旁正常組織中DDP IV的表達都明顯高于胃癌組織（P＜0.05），而且伴有轉(zhuǎn)移的胃癌組織中DDP IV的表達明顯低于無轉(zhuǎn)移的胃癌組織（P＜0.05），見圖2。

圖2 DDP IV的Western blot結(jié)果圖

2.3 DPP IV與胃癌臨床預(yù)后 根據(jù)隨訪結(jié)果，對DDP IV蛋白表達陽性組和表達缺失組的生存率進行了Kaplan Meier分析，結(jié)果見圖3。DDP IV陽性組患者的癌癥特異性生存率及癌癥無進展生存率明顯高于DDP IV表達缺失組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)過多因素分析，結(jié)果顯示DDP IV表達缺失為胃癌患者不良預(yù)后的獨立危險因子，見表2。

圖3 DDP IV表達對生存率的Kaplan Meier分析

表2 胃癌預(yù)后因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

DPP IV是20世紀60年代末在大鼠腎臟中被發(fā)現(xiàn)的，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員[9]。DPP IV基因位于2號染色體，包括26個外顯子，表達于多種細胞表面，如淋巴細胞、黑色素細胞、腸上皮細胞等。DPP IV一般以同源二聚體形式存在，其單體含有766個氨基酸殘基，相對分子量11 kD，其細胞外區(qū)域具有蛋白酶活性，該酶能從絲裂因子或神經(jīng)肽的N端切除二肽，從而使之失去活性。最初發(fā)現(xiàn)DPP IV是一種淋巴細胞分化分子[10]，在微生物感染等過程中具有免疫調(diào)節(jié)作用[11-12]；后來DPP IV被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織存在不同水平的表達降低[13-15]，并有進一步研究[16-19]發(fā)現(xiàn)其在腫瘤中起著抑制細胞增殖的作用；還有研究[20]報道DPP IV在鼻咽癌中也存在表達降低，并發(fā)揮著抑癌基因的作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)DPP IV在肺癌[21]中表達升高，張夢真等[22]通過Western blot和RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)DPP IV在卵巢癌組織中表達明顯升高，并且與臨床分期、組織學(xué)分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，從而推斷DPP IV參與了腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。SANCHEZ-OTERO等[23]對肺癌等數(shù)種肺疾病組織在蛋白質(zhì)和mRNA水平上對DPP IV進行了研究后發(fā)現(xiàn)其起著抑癌基因的作用，而且其發(fā)揮作用與p21密切相關(guān)。

本研究主要采用了免疫組織化學(xué)等常用的生物學(xué)實驗方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPP IV基本全部表達于正常的胃黏膜，而在胃癌組織中則不同程度地表達降低或缺失；而且隨著腫瘤惡性程度的增高，DPP IV的表達缺失更加明顯。進而通過Western blot方法分析發(fā)現(xiàn):與正常胃黏膜組織相比，DPP IV在胃癌組織中的表達明顯降低，在伴有轉(zhuǎn)移的癌組織中其表達降低程度更大。DPP IV的表達缺失與胃癌浸潤深度及有無淋巴結(jié)及遠處臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與其病理學(xué)類型、組織學(xué)分化程度和年齡無關(guān)，這些數(shù)據(jù)提示DPP IV在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了抑制作用。但是關(guān)于DPP IV在胃癌中的確切機制，目前研究較少，或是通過調(diào)控鉀通道的功能而影響腫瘤細胞的生長或存活而實現(xiàn)的，前者在細胞增殖、細胞周期的前進及凋亡中發(fā)揮著重要的作用。

本研究應(yīng)用Kaplan Meier相關(guān)分析對實驗數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，DPP IV的表達缺失與患者的癌癥特異性生存期及癌癥無進展生存期明顯相關(guān)；進而采用多因素Cox回歸分析后顯示DPP IV表達缺失是胃癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子，通過檢測胃癌組織中DPP IV的表達水平可以預(yù)測患者以后的病情發(fā)展趨勢。因本研究為回顧性分析，且收集到的病例數(shù)較少，對DPP IV在胃癌中的作用缺少分子生物學(xué)水平上的研究、分析。但本研究初步發(fā)現(xiàn)了DPP IV在胃癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用，DPP IV表達缺失是胃癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子，而從基因水平上探討其作用機制應(yīng)成為接下來研究的重點。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression of dipeptidyl peptidase IV gene in gastric carcinoma and its’ signifance for prognosis

TIAN

Jie, ZHANG Zhi’an, SUN Guoxing, XIAO Baozeng, ZHANG Wenchao, YANG Jitao, ZHANG Qingyong, YIN Xiao, GENG Guowang. Department of General Surgery, the People’s Hospital of Qinghe, Xingtai, 054899

Objective：To evaluate the expression of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) in gastric carcinoma tissue and matched para-tumor tissues, then its clinical pathologic signif cance for gastric carcinoma was investigated.Methods：One hundred and twelve cases gastric carcinomas tissues and the same number of matched para-tumor tissues were selected, expressive difference of DPP IV gene between carcinoma tissues and their matched para-tumor tissues was measured by immunohistiochemistry; with protein concentration level of DPP IV measured by Western blotting methods.Results：The expressive loss number for DPP IV was 3 (2.7%) in 110 normal gastric tissues, while lossed in 78 gastric carcinomas; and the level of DPP IV decreased obviously in DPP IV positive tissues; DPP IV is an independent prognostic factor of gastric carcinoma by multiple factor analysis.Conclusion：Loss of DPP IV’s expression is an independent poor prognostic factor of gastric carcinoma.

dipeptidyl peptidase IV; stomach neoplasm; pathology; prognosis胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在東方國家發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列[1-3]；多數(shù)胃癌患者病情進展較快，預(yù)后不佳。有多項研究顯示二肽酶（dipeptidyl peptidase，DDP）家族參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[4-8]，但是關(guān)于DDP IV在胃癌臨床病理學(xué)中的預(yù)后價值鮮有報道，本研究初步探討了DDP IV在胃癌預(yù)后中的價值。

R733.3

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.013

2016-03-05

田杰（1977-），男，河北清河人，主治醫(yī)師。