馬興生,賀曉英,張曉琦,劉光福，楊國儒

(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗科，山東濰坊 261041)

·臨床檢驗技術研究·

支氣管肺胞灌洗液細胞學檢測方法的改良

馬興生,賀曉英,張曉琦,劉光福，楊國儒

(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗科，山東濰坊 261041)

目的 針對支氣管肺胞灌洗液(BALF)下標本處理過程中細胞退化變形問題進行改良。方法 分別用常規(guī)方法與改良方法(BALF標本離心后的沉渣按2∶1比例加入血清或血漿)對標本涂片染色，在相同顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，計算正常形態(tài)中性粒細胞的百分率。結果 兩種涂片方法檢出的正常形態(tài)中性粒細胞百分率差異有統計學意義(P<0.01)。結論 改良方法可較好地在室溫下保持BALF標本中的細胞形態(tài)，避免細胞退化。

肺泡灌洗液；細胞退化；血清；血漿

按照目前的支氣管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)操作規(guī)范[1-3]對標本涂片處理，在實際臨床操作過程中常遇到細胞嚴重退化變形的問題。通過在臨床工作中不斷實踐與摸索，找到一種在室溫條件下能較好解決細胞退化變形問題的新方法，現介紹如下以供同行交流。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DM2500型光學顯微鏡(德國LEICA公司)，SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器公司)，HYC-310型醫(yī)用冷藏箱(青島海爾特種電器公司)，MS3BS25型漩渦振蕩器(德國IKA公司)，病理級高級載玻片(南通海倫生物醫(yī)學器材制造公司)，12×100塑料試管(淄博來緒醫(yī)用器材公司)，300目尼龍濾網(昆山鑫泰篩網濾網公司)，瑞氏-姬姆薩染色液(珠海貝索生物技術公司)，AB型血清或血漿。

1.2 標本采集及制備 2016年6至10月濰坊呼吸病醫(yī)院BALF標本20例。每位患者行支氣管鏡檢查時留取≥5 mL BALF，裝入無抗凝劑硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細胞粘附)，1 h內送檢。

1.3 評定標準 中性粒細胞形態(tài)變化更明顯并隨保存時間延長而正常形態(tài)比例明顯下降[4-5]；同樣，在常溫條件下，在計數BALF標本細胞分類時，中性粒細胞退化變形最明顯。因此，選擇以中性粒細胞的形態(tài)完整性作為衡量涂片質量的標準，并計數正常形態(tài)中性粒細胞的百分率。正常形態(tài)中性粒細胞標準：細胞形態(tài)完整，胞漿與核清晰。退化形態(tài)中性粒細胞標準：細胞胞漿不完整，核腫脹，甚至裸核或可見胞漿，不能分辨細胞核的形態(tài)。

1.4 實驗方法 對同一份BALF標本分別采用常規(guī)涂片和改良方法涂片。改良方法是在常規(guī)涂片基礎上加入人血清或血漿。具體操作步驟如下，(1)采集BALF后，盡快送達實驗室，用300目尼龍濾網過濾到塑料試管中；(2)試管迅速以2 000 r/min離心7 min；(3)離心后的標本棄去上清，取試管底部沉渣；(4)在漩渦振蕩器上把試管底部沉渣混勻；(5)按標本與血清或血漿2∶1的比例加入AB型血清或血漿于管內，與沉渣充分混勻后涂片；(6)涂片在室溫自然風干后，用瑞氏-姬姆薩染色液染色；(7)在油鏡下觀察標本，計數中性粒細胞正常形態(tài)，以百分率表示。

1.5 統計學分析 用SPSS 19.0統計軟件進行。由于2組數據方差不齊，兩組間比較用兩獨立樣本的秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常規(guī)方法和改良方法涂片鏡檢結果 見圖1。常規(guī)方法涂片中性粒細胞退化明顯，背景不清，混雜成分較多。圖1B 按2∶1比例加入AB型血清涂片，中性粒細胞形態(tài)清晰，漿、核明顯，較少有退化，背景清晰。圖1D 按2∶1比例加入AB型血漿涂片，粒細胞形態(tài)清晰，漿、核明顯，較少有退化，背景更清晰。

2.2 常規(guī)方法和改良方法正常形態(tài)中性粒細胞的百分率 改良方法組的中性粒細胞正常形態(tài)百分率明顯高于常規(guī)方法組。常規(guī)方法組的中性粒細胞正常細胞百分率(34.8±16.4)%，改良方法組(87.45±5.57)%，經兩獨立樣本的秩和檢驗比較，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 其他影響因素對實驗結果的影響 除采用AB型血清或血漿外，還采用了O型血清或血漿(含抗A、抗B抗體)實驗，中性粒細胞同樣可保持良好的完整性，涂片結果并不受血型影響。按3∶1比例分別加入各型血清或血漿進行相關實驗，顯微鏡下觀察中性粒細胞仍可保持良好形態(tài)，但按1∶1比例加入血清或血漿，涂片染色時發(fā)現膜極易脫落。

注：A、C為常規(guī)方法涂片；B、D為分別為加入血清、血漿改良處理后的涂片。

圖1 常規(guī)方法和改良方法涂片瑞氏-姬姆薩染色結果(×1 000)

3 討論

近幾年針對BALF細胞學檢測方法的改良較多[6-7]。但在臨床檢驗工作中，面臨的細胞退化問題卻無應對之策。由于細胞形態(tài)結構的完整性受溫度、pH值、抗體等多種因素影響。按目前操作規(guī)范推薦的常規(guī)涂片方法，不能保持細胞原有形態(tài)，從本質上分析是由于細胞離開機體后，內環(huán)境發(fā)生改變，細胞出現退化。若能保持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定，讓離體細胞所處環(huán)境與機體內盡可能相似，有可能解決細胞退化問題。人血清/血漿是細胞在機體內賴以生存的“土壤”，所以加入一定比例的血清或血漿，可起到保持細胞形態(tài)完整性的作用。

本實驗首先采用AB型血漿或血清，是因為AB型血清或血漿中不含有抗A、抗B抗體，盡可能減少血型抗體對實驗結果的影響。然后，為驗證血型抗體是否對結果有影響，采用O型血實驗，結果顯示不管是加入AB型，還是O型血清或血漿，均可避免細胞退化，保持細胞形態(tài)完整。從而驗證了血型抗體對結果沒有影響。在臨床中可采用各種血型的血清或血漿進行實驗，取材更加方便。為明確加入血清或血漿的最佳比例，分別按1∶1、2∶1、3∶1比例加入血清或血漿，發(fā)現按2∶1與3∶1比例結果相似，涂片后視野清晰，細胞形態(tài)完整，能夠很好的進行細胞分類計數。

此改良方法優(yōu)點在于，一方面在室溫下就可完成整個操作過程，并不需要規(guī)范要求的4 ℃低溫下進行。另一方面易取材、易操作、易推廣、低成本、低消耗、臨床實踐性強。

[1]中華醫(yī)學會呼吸病分會.支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規(guī)范(草案)[J].現代實用醫(yī)學, 2003,15(12):256-257.

[2]Kelch H,Hutter C.Clinical guidelines and indications for bronchoalveolar lavage (BAL): Report of the European Society of Pneumology Task Group on BAL[J]. Eur Respir J, 1990,3(8):937-974.

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[4]黃斌倫. 抗凝靜脈血中白細胞形態(tài)變化觀察[J]. 檢驗醫(yī)學, 2005,20(2):156-157.

[5]尹衛(wèi)東, 李立宏, 郭楨. EDTA鹽抗凝血中白細胞形態(tài)的變化[J]. 張家口醫(yī)學院學報, 1999,16(4):12.

[6]唐金鳳, 肖九長, 林霖, 等. 改良涂片法和瑞氏-姬姆薩染色法對支氣管肺泡灌洗液及痰嗜酸性粒細胞計數檢測的比較[J]. 黑龍江醫(yī)學, 2014,13(8):901-902.

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(本文編輯：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.06

馬興生，1965年生，男，主管技師，主要從事臨床檢驗工作。

楊國儒，主任醫(yī)師，E-mail：yangguoru@163.com。

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2016-12-08)