■文/川北醫(yī)學(xué)院 實驗動物中心 楊國淋 李陽友

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心與基因芯片實驗室 文心田

豬偽狂犬病診斷技術(shù)的研究進展

■文/川北醫(yī)學(xué)院 實驗動物中心 楊國淋 李陽友

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心與基因芯片實驗室 文心田

豬偽狂犬病是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化和集約化的發(fā)展，該病在我國多個省市均有報道。近年豬偽狂犬病在多個種豬場呈流行暴發(fā)趨勢，使我國養(yǎng)殖業(yè)受到巨大的經(jīng)濟損失，打擊了養(yǎng)殖戶的積極性。國內(nèi)外眾學(xué)者對其進行了大量研究，建立了多種診斷與鑒別診斷方法，為豬偽狂犬病的防治提供了相關(guān)依據(jù)。本文對豬偽狂犬病的病原學(xué)、臨床癥狀、流行以及診斷方法進行了相關(guān)論述，其中主要對診斷方法進行了介紹，可以對該病的防治提供相關(guān)理論依據(jù)。

豬偽狂犬?。辉\斷方法；進展

豬偽犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的急性傳染病，可以使多種野生動物和家畜動物感染，又稱為奧葉基氏病[1]。豬是該病的主要宿主以及傳染源，一旦發(fā)病呈暴發(fā)性流行，主要通過交配、精液、胎盤垂直傳播，引起妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔；由于胎盤屏障的作用不能免疫仔豬，所以當(dāng)病毒通過胎盤傳遞給胎兒時，感染率和死亡率可達100%，對胎兒來說是致命的；成年豬由于免疫抵抗力較強，感染一般只出現(xiàn)上呼吸道卡他性癥狀，不表現(xiàn)典型癥狀。長期攜帶毒病呈隱性感染，成為豬群養(yǎng)殖的健康隱患。本病分布很廣，而且常常和豬瘟呈混合感染趨勢[2]。20世紀(jì)，該病曾出現(xiàn)大規(guī)模的流行，后來由于基因缺失疫苗的成功研制，該病的防控取得了很好的效果。近年來有關(guān)豬偽狂犬病的報道又明顯增多，豬場中PRV的陽性比例也開始增加，成為養(yǎng)殖過程中普遍存在的問題，也成為眾多獸醫(yī)專家的研究熱點。

1 病原學(xué)特征

PRV屬于皰疹病毒科，只有一種血清型，但不同毒株在生物學(xué)和毒力等方面存在一定差異。完整病毒粒子為圓形，是雙鏈DNA病毒，有囊膜，囊膜表面呈放射狀排列的纖突[3]。病毒對高溫抵抗力強，在80℃下，3min病毒才能被殺滅；在低溫潮濕環(huán)境下，病毒能穩(wěn)定存活。PRV對氯仿、乙醚和福爾馬林等有機化學(xué)消毒劑和紫外線較敏感，在污染的豬舍能存活1個多月。PRV基因組為線狀雙鏈DNA，全長約為180kb，G+C含量高，可編碼70多種蛋白，目前命名的有g(shù)B、gC、gD、gE等11種糖蛋白，在病毒誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時起到重要作用。偽狂犬病毒的毒力是由幾種基因協(xié)同調(diào)控，主要有TK、gE、gD、gI基因，其中PRV最主要的毒力基因是TK[4]。缺失一種或幾種毒力基因，可使偽狂犬病毒毒力下降，但仍保持免疫原性，成為研究基因工程缺失苗的疫苗株。

2 臨床癥狀和病理變化

豬偽狂犬病毒株臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢、角弓反張，仔豬出現(xiàn)劃水樣、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，后期昏迷死亡(圖1)。病毒極易感染哺乳期內(nèi)的仔豬，發(fā)病急、死亡率高；成年豬一般不發(fā)生死亡，多呈隱形感染，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難，偶有神經(jīng)癥狀。母豬主要出現(xiàn)繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等，發(fā)情母豬感染偽狂犬病是返情率增高，屢配不孕；公豬感染病毒后主要表現(xiàn)為精子質(zhì)量下降、睪丸發(fā)生腫脹、最后萎縮，喪失種用能力[5]。

PRV感染的豬剖解主要表現(xiàn)為上呼吸道和胃腸黏膜，以及扁桃體發(fā)生出血水腫和炎癥。腦膜充血、出血、水腫發(fā)生腦脊髓炎導(dǎo)致神經(jīng)癥狀。染病動物一般可見肺有充血、水腫和壞死灶，脾臟和肝臟有灰白色壞死灶(圖2、圖3)，扁桃體水腫并有壞死灶(圖4)，胃黏膜有卡他性炎癥。慢性病例可表現(xiàn)為育肥豬發(fā)生肺炎，其他動物均為非化膿性腦炎。在顯微鏡下可見清晰的血管套及膠質(zhì)細胞壞死(圖5)。

圖1 仔豬臨床癥狀

圖2 脾臟病變

3 診斷技術(shù)

豬偽狂犬病與豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病、豬布氏桿菌病、豬瘟等豬繁殖障礙病臨床癥狀相似，難以區(qū)分。根據(jù)該病的典型臨床癥狀及病理變化特點，只能做初步診斷，為了能確診豬偽狂犬病還需進行實驗室檢查。目前實驗室常用的診斷該病的方法有病原學(xué)的病毒分離與鑒定、血清學(xué)試驗、分子生物學(xué)技術(shù)等。

3.1 病毒分離與鑒定

病毒分離鑒定是診斷偽狂犬病最可靠的方法，但是比較耗時耗力，對材料的要求高，腦組織和扁桃體常作為分離病毒檢樣的最佳材料，經(jīng)處理后接種到健康的動物或細胞培養(yǎng)物進行感染。一般病毒接種后3日齡左右出現(xiàn)典型的細胞病變，染色鏡檢后，可在細胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)酸性包涵體。電鏡下可以觀察到偽狂犬的病毒粒子是二十面體對稱的圓形或橢圓形，其直徑大小為110～150nm左右，位于胞漿內(nèi)，為成熟的病毒粒子，一般帶有囊膜的病毒粒子，直徑大小為150～180nm左右，囊膜外有呈放射狀排列的纖突。唐婕[6]應(yīng)用電鏡觀察偽狂犬病毒的外形，發(fā)現(xiàn)具有子彈狀形態(tài)特點，能與鵝紅細胞產(chǎn)生凝集反應(yīng)，且附著在鵝紅細胞表面易于辨認。該方法對病毒的檢測直觀、形象、快速，但對病毒滴度要求高，并需要熟練的技術(shù)人員。

圖3 肝臟病變

圖4 扁桃體發(fā)病

3.2 血清學(xué)試驗

血清學(xué)方法是利用抗體診斷技術(shù)進行診斷，在臨床上是偽狂犬病診斷常見的方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血清中和試驗(SNT)、免疫熒光技術(shù)(FA)、乳膠凝集試驗(LAT)、以及瓊脂擴散試驗(AGID)等。3.2.1 免疫熒光抗體試驗 免疫熒光技術(shù)是用熒光標(biāo)記抗原或抗體，用來跟蹤檢測目標(biāo)物，該方法特異性強，可以在熒光顯微鏡下觀察。Allan等[7]首次對人工感染豬偽狂犬病毒的豬和自然狀態(tài)下感染豬偽狂犬病毒豬的腦組織和咽喉組織進行壓印片，然后利用間接免疫熒光試驗進行檢測，該方法能檢測的靈敏度為101.3TCID50/g，在實驗過程中不需要進行細胞培養(yǎng)和冷凍切片等復(fù)雜步驟，在2h內(nèi)便得出試驗結(jié)果。魏鳳等[8]采用PCR技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)從山東某豬場分離到一株豬偽狂犬病毒，與NCBI中收錄的病毒基因組同源序列為96%～98%。3.2.2 血清中和試驗 血清中和試驗試管是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)，進行疾病診斷的一種血清方法。高俊峰等[9]從臨床中分離到一株偽狂犬病毒株，用該毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株進行中和試驗，確定該毒株可以作為候選疫苗毒株；TQ等[10]從6省市15個豬場采集臨床樣品，分離到豬偽狂犬的變異毒株，用中和試驗的方法測定豬偽狂犬Bartha-K61疫苗株的效價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗對傳統(tǒng)毒株的免疫保護力為100%，但是對變異毒株的保護力僅為50%，不能作為豬偽狂犬的保護疫苗。3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA是診斷豬偽狂犬病最常用的方法之一。van Oirschot等[11]利用抗原抗體能特異結(jié)合的原理，抗原用感染后的單層細胞，抗體用抗gE表位的單克隆，建立了可以檢測豬偽狂犬病毒的gE抗體ELISA。Morenkov等[12]構(gòu)建了親和層析gE-ELISA和gE-ELISA兩種血清檢測方法，這兩種方法能夠區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的動物，特異性和敏感性都較好。譚春萍等[13]采用ELISA對廣西部分地區(qū)偽狂犬病的流行情況進行了調(diào)查和分析，得出不同地區(qū)和不同規(guī)模的豬場偽狂犬病的感染率不同的結(jié)論；曹三杰等[14]構(gòu)建的偽狂犬病毒斑點ELISA，能夠特異敏感地檢測IgG的病毒含量。目前哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的Dot-ELISA試劑盒已投入使用，且臨床檢測效果好。

圖5 膠質(zhì)細胞病變

3.2.4 乳膠凝集試驗 乳膠凝集試驗(LAT)和血清學(xué)試驗的原理相似，也是利用抗體和抗原特異性結(jié)合原理，首先用乳膠包被抗原，然后與血清反應(yīng)后通過凝集現(xiàn)象來判斷結(jié)果。如兩者發(fā)生凝集現(xiàn)象，便可診斷為有PRV感染，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。乳膠凝集試驗最大的特點是能夠檢測IgM抗體，從而來判斷早期感染。舒銀輝等[15]采用乳膠凝集試驗和中和試驗研究所制備滅活苗的免疫原性，試驗結(jié)果分析所制備滅活疫苗的免疫效價都很高，具有良好的免疫效果。吳斌等[16]通過比較乳膠凝集試驗和血清中和試驗間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法在統(tǒng)計學(xué)上沒有明顯的差別。

3.3 分子生物學(xué)技術(shù)

3.3.1 核酸探針技術(shù) 豬偽狂犬病由于大多呈隱形感染，病毒基因潛伏在組織器官中，不表現(xiàn)臨床癥狀。探針核酸技術(shù)能在基因水平上對偽狂犬病毒進行診斷，Maes等[17]首先分離偽狂犬病毒，然后用地高辛和生物素標(biāo)記的探針，診斷出豬偽狂犬DNA后，對組織切片進行原位雜交，檢出單細胞水平上潛伏感染的病毒DNA。史喜菊等[18]采用探針核酸技術(shù)能夠?qū)α鞲胁《?SIV)、偽狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)同時進行診斷。

3.3.2 PCR技術(shù) PCR技術(shù)是20世紀(jì)80年代建立起來的一種體外擴增DNA的分子生物學(xué)技術(shù)，該方法具有快速、靈敏度高、節(jié)約時間、特異性強等優(yōu)點，在豬偽狂犬病的檢測中得到廣泛應(yīng)用。Harding等[19]針對偽狂犬gD基因設(shè)計引物，建立能區(qū)分動物間的不同皰疹病毒的PCR方法。余秋穎等[20]采用PCR技術(shù)對分離的豬偽狂犬病毒的gE、TK、gD基因進行擴增，克隆、測序分析，與參考毒株進行對比分析親緣關(guān)系。Zhang等[21]根據(jù)病毒的不同基因進行設(shè)計引物，建立多重PCR診斷技術(shù)可以將疫苗株和野毒株區(qū)分開來。Cao等[22]建立了檢測豬偽狂犬病等幾種常見豬繁殖障礙病的多重PCR方法，檢測了多例多系統(tǒng)衰竭綜合征仔豬，該法靈敏度高，特異性好，能應(yīng)用于臨床檢測，并可用于診斷野毒感染病例。吳旭錦等[23]在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化體系和反應(yīng)條件建立了套式PCR技術(shù)，能夠?qū)ωi偽狂犬病毒進行特異性的檢測。

3.3.3 熒光定量PCR技術(shù) 實時熒光定量PCR與普通PCR技術(shù)相比較具有更高的敏感性和特異性。Wu等[24]采用實時熒光定量PCR技術(shù)對建立了可同時檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬瘟、豬細小病毒和豬乙腦6種常見的感染疾病的診斷方法，可檢測10 copies/μL的病毒含量。鄭敏等[25]根據(jù)豬偽狂犬病病毒gE基因序列，建立了可區(qū)別基因缺失疫苗株和野毒株的熒光定量PCR檢測方法，并對30份疑似病料進行臨床檢測，靈敏度可達2.23×10拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測方法高100倍。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，具有特異性好，靈敏度高，高通量一次試驗可以檢測多種病原，具有其他技術(shù)無法比擬的優(yōu)點。目前被用于基因分型、疾病診斷、基因表達譜測定的各個生命科學(xué)領(lǐng)域。Paulus等[26]采用昂飛公司的基因芯片分析宿主在感染豬偽狂犬的中央神經(jīng)系統(tǒng)基因的表達量，結(jié)果顯示感染后的表達量大大增加，有的比未感染的組織高達100倍。常曉霞[27]在結(jié)合鏈霉親和素與生物素的特異性結(jié)合，利用酶與底物顯色放大原理，構(gòu)建了可以同時檢測豬偽狂犬、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型聯(lián)合共檢可視化基因芯片，構(gòu)建的芯片靈明度高，能夠特異的檢測出三種病原。

4 防控

雖然診斷偽狂犬病的方法很多，但是每種方法都有各自的優(yōu)缺點，遇到不同情況采取不同的措施。診斷時可首先根據(jù)臨床病變的特征和流行病學(xué)調(diào)查，對病原進行初步診斷，然后要采取實驗室手段進行確診，制定相應(yīng)的防控措施。目前多數(shù)豬場都存在該病毒的隱性感染，臨床上不發(fā)病，但長期帶毒，是重要的傳染源，難以根除。建立一種能區(qū)分野毒感染和疫苗免疫毒株的診斷方法，對于凈化豬場起到是十分重要的[28]。

疫苗接種是該病最有效的防控措施，目前使用的豬偽狂犬疫苗有弱毒疫苗、重組病毒疫苗、滅活疫苗、基因缺失苗。豬只在流通過程中很容易造成PRV的傳播和該病的流行，因此在引種時要嚴(yán)格監(jiān)控，避免攜帶病毒的豬；加強生物安全管理，定期消毒、滅鼠；在飼養(yǎng)密度方面實行“小產(chǎn)房”、“小保育”、“低密度”、“分階段飼養(yǎng)”的飼養(yǎng)模式，加強豬群的日常飼養(yǎng)管理和保健預(yù)防。本病一旦確診，應(yīng)該根據(jù)國家相關(guān)規(guī)定采用隔離、消毒等措施，盡快撲滅?？傊瑢τ趥慰袢〉姆揽貞?yīng)遵循“以防為主”的原則，在平時的日常飼養(yǎng)管理過程中做好生物安全工作，一旦發(fā)現(xiàn)該病要及時處理，爭取在發(fā)病初期就將病原消滅?！?/p>

[1] 甘孟候,楊漢春.中國豬病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

[2] 吳憶春.某豬場豬偽狂犬病病毒與豬瘟病毒混合感染的診斷[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2014(6):171～174.

[3] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1985.

[4] Liu W, Yi Y, Mei M, et al. Molecular Cloning, Bioinformatics Analysis of gL Gene of Pseudorrabies Virus Wild Strain SL[J].International Conference on Bioinformatics & Biomedical Engineering,2011:1～6.

[5] Ghanem A, Conzelmann K K. G gene-def i cient single-round rabies viruses for neuronal circuit analysis[J]. Virus Research, 2015, 216:41～54.

[6] 唐婕.狂犬病毒的電鏡檢測及其糖蛋白基因的克隆與序列分析[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[7] Allan G, Mcnulty M, Mccracken R, et al. Rapid diagnosis of Aujeszky's disease in pigs by immunof l uorescence [J]. Research in veterinary science, 1984, 36(2): 235～239.

[8] 魏鳳,張文通,郭廣君,等.一株豬偽狂犬病病毒的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(21):183～184.

[9] 高俊鋒,賴志,舒銀輝,等.豬偽狂犬病毒C株的分離鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015(1):32～36.

[10] An T Q, Peng J M, Tian Z J, et al. Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, 2012.[J]. Emerging Infectious Diseases, 2013, 19(11):1749～55.

[11] J.T van Oirschot, M.J Kaashoek, M.A Maris-Veldhuis ,et al. Strains of bovine herpesvirus 1 that do not express an epitope on glycoprotein E in cell culture still induce antibodies that can be detected in a gE-blocking ELISA [J]. Veterinary Microbiology,1999,65(2):103～113.

[12] O.S. Morenkov, Yu.A. Sobko, O.A. Panchenko.Glycoprotein gE blocking ELISAs to differentiate between Aujeszky's disease-vaccinated and infected animalsOriginal Research Article[J].Journal of Virological Methods, 1997, 65(1): 83～94.

[13] 譚春萍,黃福標(biāo),于冬玲,等.廣西部分地區(qū)豬偽狂犬病流行情況調(diào)查與分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(12):122～123.

[14] 曹三杰,文心田.Dot-PPA-ELISA檢測豬血清偽狂犬病抗體的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2004, 26(3): 213～215.

[15] 舒銀輝,楊雷,黃文輝,等.豬偽狂犬病不同佐劑滅活疫苗對兔免疫原性初探[J].中國獸藥雜志,2011,45(12):19～22.

[16] 吳斌,陳煥春,何啟蓋,等.應(yīng)用乳膠凝集試驗進行豬傳染性萎縮性鼻炎血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(6):21～22.

[17] Maes R K, Sussman M D, Vilnis A, et al. Recent developments in latency and recombination of Aujeszky's disease (pseudorabies) virus [J]. Veterinarymicrobiology, 1997, 55(1): 13～27.

[18] 史喜菊,馬貴平,喬彩霞,等.多重連接探針擴增(MLPA)技術(shù)同時檢測五種病毒的研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2013,21(6):745～752.

[19] Huang C, Hung J-J, Wu C-Y, et al. Multiplex PCR for rapid detection of pseudorabies virus, porcine parvovirus and porcine circoviruses [J]. Veterinary microbiology, 2004, 101(3): 209～214.

[20] 余秋穎,常洪濤,陳文定,等.2012～2013年新流行豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及其gE、TK、gD基因序列分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2014,34(10):1573～1578.

[21] Chaolin Zhang, Linghua Guo, Xiangrui Jia ,et al. Construction of a triple gene-deleted Chinese Pseudorabies virus variant and its eff i cacy study as a vaccine candidate on suckling piglets[J].Vaccine, 2015,33(21): 2432～2437.

[22] Cao S, Chen H, Zhao J, et al. Detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus and porcine pseudorabies virus from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by multiplex PCR [J]. Veterinary research communications, 2005, 29(3): 263～269.

[23] 吳旭錦,朱小甫.豬偽狂犬病病毒套式PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2016,37(6):18～21.

[24] Wu H, Rao P, Jiang Y, et al. A sensitive multiplex real-time PCR panel for rapid diagnosis of viruses associated with porcine respiratory and reproductive disorders.[J]. Molecular & Cellular Probes, 2014,28(5～6):264～270.

[25] 鄭敏,毛凝,黃梅清,等.豬偽狂犬病毒Taqman-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,17:37～41.

[26] Paulus C, Sollars P J, Pickard G E, et al. Transcriptome Signature of Virulent and Attenuated Pseudorabies Virus-Infected Rodent Brain[J]. Journal of Virology, 2006, 80(4):1773～86.

[27] 常曉霞.豬偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型聯(lián)合共檢可視化基因芯片檢測技術(shù)研究[D].淮安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[28] 劉萍,郝立建.豬偽狂犬病防治[J].四川畜牧獸醫(yī),2014,41(4):51～52.