■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

一株豬源B型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

對山東惠民某豬場豬病料進行病原菌的分離，對分離菌進行形態(tài)學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗和PCR鑒定。結果成功分離到一株莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌，該菌的分離鑒定為自家滅活菌苗的制備提供了候選菌株。

多殺性巴氏桿菌；莢膜血清B型；分離鑒定

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是一種重要的病原菌，對多種動物和人均有致病性。Pm可引起豬巴氏桿菌病(Swine pasteurellosis)，該病又叫豬肺疫，俗稱“鎖喉風”或“腫脖子瘟”。急性病例為出血性敗血病、咽喉炎和肺炎的病狀，慢性病例主要為慢性肺炎癥狀，散發(fā)性發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失[1]。Pm分為A、B、D、E和F等5個莢膜血清型[2]，其中B型是導致我國豬巴氏桿菌病的主要病原[3,4]。Townsend等[5]建立了多殺性巴氏桿菌PCR鑒別和分型方法，已得到國內研究者的廣泛應用[6,7]。2016年8月山東省惠民某豬場，豬呼吸困難、咳嗽、食欲廢絕、腹瀉，開始個別死亡，然后病情迅速蔓延，出現(xiàn)大量死亡。剖檢可見鼻腔有膿性分泌物，咽喉部黏膜充血、水腫；支氣管、氣管出血，內有多量泡沫狀粘液；內臟器官廣泛出血，胸腔、心包內有大量積液，肺臟與胸壁粘連，充血、水腫并伴有不同程度的實變，肝腫大、有小壞死灶，胃、腸黏膜出血，淋巴結水腫。本試驗采集病死豬的心血、肝臟、脾臟等病料，對采集病料進行細菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗及PCR鑒定，確定此分離株是豬源B型多殺性巴氏桿菌。

1 材料

1.1 病料

對山東省惠民某豬場疑似巴氏桿菌病死豬進行剖檢，無菌采取心血、肝臟、脾臟等病料。

1.2 試驗用動物

20只16～20g清潔級昆明系小鼠，購自山東省實驗動物中心。

1.3 試劑

草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液、普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板及血清肉湯培養(yǎng)均由山東綠都生物科技有限公司質量監(jiān)察部提供；生化試驗用各種試劑及糖發(fā)酵管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL2000 Marker、Taq酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；基因組DNA小量抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。

1.4 PCR引物設計

參照文獻[5]設計豬多殺性巴氏桿菌PCR鑒定和分型引物，鑒定引物用于擴增KMT1基因片段，擴增片段長度為460bp，分型引物分別用于擴增A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD，擴增片段長度分別為1,044bp、760bp、657bp、511bp和851bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

表2 分離菌的生化反應結果

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

在無菌條件下，分別將無菌采取病死豬的心血、肝臟、脾臟涂片或觸片，干燥、固定、革蘭氏染色、鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

2.2 細菌分離培養(yǎng)

將采集的豬心血、肝臟、脾臟無菌劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[8]。挑取單個可疑菌落接種于麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。

2.3 生化鑒定

分別將分離菌經24h鮮血瓊脂平板純培養(yǎng)后，進行糖發(fā)酵試驗及其他生化試驗。

2.4 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)將所分離的巴氏桿菌24h血清肉湯純培養(yǎng)物10倍稀釋后，接種于鮮血瓊脂平板上，每個平板接種0.2mL，并將其涂布均勻。然后用無菌鑷子將各種藥敏片分別平放在培養(yǎng)基表面，保持紙片間適度距離，37℃溫箱24h。觀察結果并測量抑菌圈直徑。

2.5 致病性試驗

20只小白鼠，隨機分兩組，每組10只。無菌吸取上述經生化鑒定的分離菌培養(yǎng)物，腹腔分別注射10只試驗組小白鼠，每只注射0.2mL(2×109CFU/mL)，10只對照分別腹腔注射0.2mL血清肉湯作對照。注射后小白鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況。并對死亡小白鼠的心血、腦、脾進行細菌分離。

2.6 PCR鑒定及分型

挑取血液瓊脂平板上單個菌落，接種于含5%小豬血清的馬丁液體培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm，振蕩培養(yǎng)20h，用基因組DNA小量抽提試劑盒(上海華舜生物技術有限公司)提取分離菌株的基因組DNA作為PCR的模板，進行PCR擴增。反應體系(50μL)：10×Buffer(含MgCl2)5μL、上下游引物各2μL(20pmol/L)、dNTP 4μL、TagDNA聚合酶0.5μL、模板1μL，加水補足至50μL。擴增反應程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃ 7min。分型采用多重PCR，反應體系與條件同上。取5μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物回收，連接到pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，挑取單菌落，搖床培養(yǎng)，將鑒定陽性的質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

3 結果與分析

3.1 直接涂片鏡檢結果

心血涂片肝臟、脾臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陰性短小桿菌，瑞氏染色成典型的兩極著色。

表3 分離菌株的藥物敏感性試驗結果

圖1 分離菌株的PCR鑒定

圖2 分離菌株的PCR分型

圖3 測序結果

3.2 細菌分離培養(yǎng)結果

在鮮血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24h后，形成表面光滑濕潤、圓形隆起、邊緣整齊、微藍色閃光的菌落，菌落周圍不溶血。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌，瑞氏染色成典型的兩極著色。在麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上未見生長。

3.3 生化試驗結果

由表2可知，從病死豬中分離的巴氏桿菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、山梨醇，不能發(fā)酵肌醇、水楊苷、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，靛基質試驗陽性，V-P試驗陰性，與巴氏桿菌的生化特征一致。

3.4 藥物敏感性試驗結果

由表3可知，分離菌對頭孢曲松、氟苯尼考、左氧氟沙星高度敏感，對氨芐西林、萬古霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星低度敏感，對阿奇霉素、羅紅霉素、四環(huán)素、新霉素、磷霉素、復方新諾明耐藥。

3.5 致病性試驗

分離菌的血清肉湯純培養(yǎng)物注射試驗組的小白鼠24h后，均表現(xiàn)精神沉郁、活動減弱、呼吸急促、采食減少，對照組無此現(xiàn)象。試驗組小鼠在接種72h內全部死亡。剖檢死亡小鼠可見胸腔有漿液性纖維素性滲出物，心外膜有出血點，肺出血、壞死。取肺組織涂片，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。對照組小白鼠未見異常。

3.6 PCR鑒定及分型

采用鑒定引物對分離菌進行PCR檢測，結果顯示，在460bp處有一特異性條帶(見圖1)，說明分離到的菌為多殺性巴氏桿菌，用5對分型引物混合進行多重PCR，結果顯示該分離菌株在760bp左右有一條特異性條帶(見圖2)，說明所分離到的病原菌為豬B型多殺性巴氏桿菌。

3.7 基因克隆的測序分析

目的基因回收后，連pMD18-T載體，轉化DH5a，采用PCR方法篩選陽性菌落，同時將含有插入片段的陽性質粒送去測序。測序結果見圖3，將測得序列與GenBank中的進行同源性比較，與巴氏桿菌B型序列(登錄號AF169324)同源性為100%。

4 討論

本試驗對山東惠民豬場病料進行細菌分離，以表型特征為依據(jù)初步鑒定為Pm，采用常規(guī)的鑒定方法如生化試驗、藥敏試驗和動物致病性試驗進行鑒定，并參照Townsend等[5]建立了多殺性巴氏桿菌鑒定和分型方法，對分離菌進行分子水平的鑒定，表明分離菌為多莢膜B型多殺性巴氏桿菌，PCR方法極大地縮短了從病原上診斷該病的時間，從而為豬多殺性巴氏桿菌病的快速診斷提供了有力的工具。生化試驗結果表明，該分離菌生化特征與巴氏桿菌的一致，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、山梨醇，不能發(fā)酵肌醇、水楊苷、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，靛基質試驗陽性，V-P試驗陰性，藥敏試驗結果表明，該分離株對頭孢曲松、氟苯尼考、左氧氟沙星高度敏感，對氨芐西林、萬古霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星低度敏感，對阿奇霉素、羅紅霉素、四環(huán)素、新霉素、磷霉素、復方新諾明有明顯耐藥性。建議豬場在防治巴氏桿菌病時，對分離病源菌進行藥敏試驗，找到最有效的藥物，用2～3種敏感藥物交替使用，才能收到事半功倍的效果。動物回歸試驗表明，小白鼠致死后，再次分離細菌仍然為莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌，表明該菌株具有較強的毒力。該菌的成功分離鑒定，為臨床診斷和治療提供可靠依據(jù)，為進一步開展巴氏桿菌的分子生物學研究、診斷試劑研制以及自家滅活菌苗的制備等方面的研究奠定了基礎?！?/p>

[1] 徐引弟,王治方,朱文豪,等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志,2011,45(5):5～7.

[2] Carter GR. Pasteurellosis:Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica[J]. Adv Vet Sci, 1967,11:321～379.

[3] 吳范庚.我國多殺性巴氏桿菌血清學鑒定及交互免疫試驗[J].中國獸醫(yī)雜志,1997,23(8):14～15.

[4] 郭大和,鄭明,潘松年.我國多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的血清學鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報,1979,10(2):67～77.

[5] Townsend KM, Boyce JD, Chung JY, et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol,2001,39(3):924～929.

[6] 馬文戈,于力.豬源莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2008,30(10):747～754.

[7] 李永明,羅阿東,徐景峨,等.豬源多殺性巴氏桿菌的生物學鑒定與莢膜PCR分型[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(7):506～509.

[8] 胡桂學.獸醫(yī)微生物實驗教程[M].北京:中國農業(yè)大學出版社,2006:35～38.

山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬產業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-08-17)。