鄒孟達，熊青，鄧青松，蔣家云，陳施翰，夏鋒，馬寬生，別平

（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院 肝膽外科，重慶 400038）

肝癌是世界第五大常見腫瘤，其病死率在腫瘤中居第3位[1]。射頻消融術(shù)（radiofrequency ablation，RFA）做為治療肝癌的常規(guī)方式之一，具有療效顯著，創(chuàng)傷小，可重復(fù)操作，安全及住院時間短等優(yōu)點[2]。臨床研究中，直徑＜3cm的肝癌的RFA治療效果同手術(shù)切除相比其3年總體生存率無顯著差異[3]。但RFA術(shù)也存在缺陷，主要表現(xiàn)在其一次性毀損的腫瘤體積有限，較大的腫瘤行RFA術(shù)后難以全部毀損，易產(chǎn)生殘癌。有文獻[4]報道指出，對于直徑約5cm的肝癌行RFA后其殘癌發(fā)生率可達30%～50%。因而，如何有效地增強RFA一次性的毀損體積，抑制殘癌的生長已成為提高RFA療效的關(guān)鍵。

基于RFA的基本原理，目前研究主要通過局部注射高滲鹽水、乙醇、醋酸等來增加癌灶內(nèi)離子濃度，從而增強RFA的毀損效應(yīng)[5-7]。但是，局部注射難以使離子在癌灶內(nèi)均勻分布，注射處離子濃度較高，而稍遠處離子則不易彌散到，因而在行RFA時容易造成局部組織碳化而阻礙熱量的傳遞，最終影響RFA療效的提高。另外，局部注射時穿刺針的插入與拔出會增加癌細胞播散的幾率。針對以上問題，本課題設(shè)想合成一種能直接通過血管注射，具有較好腫瘤靶向功能的納米金（gold nanoparticles，GNPs）復(fù)合物，同時攜帶VEGFsiRNA基因。一方面GNPs能增加癌灶內(nèi)離子濃度，且通過血管注射可使GNPs在腫瘤中分布相對均勻；另一方面VEGFsiRNA可抑制殘癌生長，從而更好的增強RFA的損傷效應(yīng)。

在本課題的前期研究中，課題組已成功合成GNPs-CPEI-G-PEG-TyrRGD/VEGFsiRNA復(fù)合物（TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA），合成方法參照文獻[8]報道。其中GNPs為直徑10～20 nm的金微小顆粒，作為增加腫瘤病灶內(nèi)離子濃度的材料，增強RFA的直接損傷效應(yīng)。環(huán)五肽RGD[cyclo-（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys），TyrRGD]作為靶向腫瘤細胞的分子材料，能與幾乎只在腫瘤細胞以及腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞高度特異性表達的αvβ3特異結(jié)合[9]。VEGFsiRNA通過降解與之同源的mRNA，抑制肝癌中高表達的VEGF及其受體，從而抑制體內(nèi)肝癌的生長[10-11]。

前期課題研究通過TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物與肝癌細胞共培養(yǎng)，已證實該復(fù)合物與肝癌細胞的結(jié)合能力顯著強于正常肝細胞，在30%濃度下對正常肝細胞無毒性作用；同GNPs相比，該復(fù)合物具有更好的離散性，且更容易與肝癌細胞相結(jié)合；在對離體豬肝行RFA試驗中，也證明注射該復(fù)合物能顯著增大RFA的毀損直徑[12]。本文是在課題前期研究的基礎(chǔ)上，進行TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物的體內(nèi)實驗，探討TyrRGDGNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物是否可增強RFA對兔肝臟VX2腫瘤的毀損效應(yīng)以及對殘癌組織生長的影響。

1　材料與方法

1.1　主要材料與試劑

63只新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)在西南醫(yī)院動物實驗室，所有動物實驗均遵循第三軍醫(yī)大學(xué)動物管理委員會的規(guī)定。VX2實體瘤組織塊購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)公司，羅氏TUNEL凋亡試劑盒購買于德國羅氏公司（德國），TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物由課題組提供，GNPs溶液購買于上海滬正納米科技有限公司，戊巴比妥鈉購買于北京索萊寶科技有限公司，DAB顯色試劑盒購買于北京中杉生物技術(shù)有限公司，4%多聚甲醛購買于武漢博士德生物工程有限公司。射頻治療儀采用OLYMPUSCELON POWER射頻消融系統(tǒng)，由西南醫(yī)院肝膽外科提供，購買于北京貝恩醫(yī)藥科技開發(fā)有限責(zé)任公司。其他材料由西南醫(yī)院肝膽外科實驗室提供。

1.2　實驗方法

1.2.1建立VX2兔肝癌模型 VX2腫瘤是兔乳頭狀瘤經(jīng)Shope病毒誘導(dǎo)而形成的一種可植入的鱗狀細胞腫瘤，該腫瘤可在兔肝上生長并同人肝細胞癌有許多生物相似性，所以常作為研究肝癌介入治療的理想動物模型。模型建立方法參照文獻[13]。VX2腫瘤細胞系靠植入荷瘤兔后腿大腿肌肉中維持傳代。動物由3%戊巴比妥鈉（按1 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉。從荷瘤兔中收取魚肉狀的VX2新鮮組織，置于無菌生理鹽水中備用。取劍突下腹部正中切口，逐層入腹，暴露肝左葉，并在其較厚處用眼科鑷建一8 mm深竇道，將腫瘤組織切成1 mm3大小，植入竇道底部，海綿明膠封閉竇道口，關(guān)腹。3周后，通過超聲觀察VX2兔肝腫瘤生長狀況，通過測量，腫瘤直徑分布在1.8～2.3cm范圍。

1.2.2透射電鏡觀察標(biāo)本 取6只VX2兔，分兩組，每組3只。經(jīng)耳緣靜脈分別注射TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù) 合 物 0.2 mL，GNPs液 0.2 mL。48 h后處死動物，取腫瘤標(biāo)本，經(jīng)2.5%戊二醛保存后送學(xué)校電鏡室制片，觀察。

1.2.3RFA操作 取30只VX2兔，分3組，每組10只。經(jīng)耳緣靜脈分別注射TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物溶液，GNPs液及生理鹽水各0.2 mL。48 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉、剃毛、消毒，固定于操作臺上。超聲定位腫瘤部位和進針路線，射頻針穿刺至腫瘤中心部位，開始射頻操作，起始功率設(shè)定為20 W，射頻時間5 min。射頻結(jié)束后，燒灼針道，退出射頻針，觀察有無出血。實驗兔返回動物喂養(yǎng)室觀察。

1.2.4測量RFA毀損體積及殘癌細胞凋亡 RFA治療48 h后，每組各取10只實驗兔，麻醉后取腫瘤標(biāo)本，沿射頻針道橫截面切開腫瘤，測量毀損灶的長短徑（長徑a，短徑b，單位：cm），并根據(jù)公式計算毀損體積：毀損體積=0.5×a×b2。殘癌細胞凋亡測定按羅氏TUNEL試劑盒說明書進行。

1.2.5生存時間測定 實驗分3組，每組9只，即RFA聯(lián)合TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組，RFA聯(lián)合生理鹽水組及生理鹽水組，飼養(yǎng)至其自然死亡，記錄生存時間。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 18統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1　TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物具有較好的靶向性

透射電鏡觀察VX2腫瘤標(biāo)本，TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物在500 nm視野下出現(xiàn)的顆粒數(shù)為（14.2±2.6）顆，且分布較好；而GNPs在500 nm視野下顆粒數(shù)為0，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）（圖1）。

圖1　電鏡觀察TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物與GNPs在腫瘤細胞中的聚集（×50 000） A：電鏡下TyrRGDGNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物形態(tài)；B：GNPs組；C：TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組Figure 1 Gathering of TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA and GNPs in tumor tissue cells detected by electron microscope (×50 000)A: The morphology of TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA under electron microscope. B: GNPs group. C: TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA group

2.2　RFA治療后各組毀損體積比較

VX2兔行RFA后，根據(jù)相應(yīng)公式計算出其毀損體積。其中，注射TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組毀損體積為（5.12±2.12）cm3；GNPs組為（1.78±0.46）cm3，生理鹽水組為（1.49±0.44）cm3。TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組的毀損體積明顯大于GNPs組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），GNPs組和生理鹽水組間毀損體積比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖2）。另外，在RFA中由于其熱效應(yīng)而產(chǎn)生的氣體在超聲圖像里表現(xiàn)為強烈的白色光團，其大小也可間接反映射頻消融的毀損效應(yīng)，TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組的光團明顯大于其余兩組（圖2）。

圖2　RFA術(shù)后各組腫瘤毀損體積檢測 A：通過直尺和B超分別測量各組腫瘤的毀損體積；B：各組毀損體積比較Figure 2 Detection of ablation volume of the tumor of each group after RFA A: Measurement of damage volume by ruler and ultrasound;B: Comparison of ablation volumes among groups

2.3　HE染色及TUNEL法測凋亡

VX2兔行RFA后，腫瘤標(biāo)本經(jīng)HE染色可看到界限清楚的3個區(qū)域，即腫瘤完全壞死區(qū)、壞死周邊區(qū)及殘癌區(qū)。經(jīng)TUNEL法染色后，壞死細胞表現(xiàn)為棕色（圖3）。TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組中殘癌區(qū)域可觀察到片狀棕黃色細胞壞死區(qū)，而在GNPs組和生理鹽水組相應(yīng)區(qū)域則未見明顯的細胞壞死區(qū)域（圖3）。熒光顯微鏡100倍視野下計數(shù)殘癌區(qū)域內(nèi)凋亡細胞，其中TyrRGDGNPs-VEGFsiRNA組凋亡細胞數(shù)為（111.7±12.2）個，GNPs組為（36.3±3.8）個，生理鹽水組為（34.7±6.1）個。TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組殘癌區(qū)凋亡細胞顯著多于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），GNPs組和生理鹽水組殘癌區(qū)域內(nèi)凋亡細胞數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3　各組殘癌細胞凋亡檢測 A：HE染色（×40）；B：TUNEL染色（×40）；C：TUNEL染色（×100）；D：凋亡細胞計數(shù)Figure 3 The apoptosis detection in the residual cancer cells A: HE staining (×40); B: TUNEL staining (×40); C: TUNEL staining(×100); D: Counts of apoptosis cells

2.4　生存時間

本研究中自然死亡的VX2兔共計27只，以3個月為觀察期限，動物死亡率100%。飼養(yǎng)過程中只在RFA治療前分別注射了TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA溶液及生理鹽水。其中RFA聯(lián)合TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組的9只，平均生存時間70.9 d，其中6只有廣泛的腹腔轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率54%；RFA聯(lián)合生理鹽水組的9只，平均生存時間51.2 d，全部有腹腔轉(zhuǎn)移；生理鹽水組的9只，平均生存時間43.9 d，全部有腹腔轉(zhuǎn)移。RFA聯(lián)合TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA組生存時間明顯長于RFA聯(lián)合生理鹽水組和生理鹽水組（P＜0.01），RFA聯(lián)合生理鹽水組的生存時間也長于生理鹽水組（P＜0.01）。生存曲線見圖4。

圖4　各組兔生存時間比較Figure 4 Comparison of survival time among groups of rabbits

3　討 論

RFA是臨床常用于治療肝癌（包括原發(fā)性和繼發(fā)性）以及其他實體腫瘤的微創(chuàng)治療方法[14]。目前，RFA技術(shù)的主要缺陷在于其能夠有效毀損腫瘤的體積有限[15-17]。研究[14,16,18]報道對于直徑＞5cm的腫瘤，RFA治療后殘癌發(fā)生率在10%～40%。Gannon等[19]研究證明，GNPs能夠增強RFA對肝癌細胞的毀損效應(yīng)，擴大毀損體積，且毀損效應(yīng)隨著GNPs濃度增加而增強，此外已證實進入細胞內(nèi)的GNPs對細胞無毒性作用。同時多項研究表明GNPs可以偶聯(lián)腫瘤特異性標(biāo)志物或腫瘤相關(guān)的靶向分子（如：抗體、多肽、藥物）而靶向體內(nèi)的惡性腫瘤細胞，從而使體內(nèi)的實體腫瘤得到有效可行的治療。本課題組合成的TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物，即是腫瘤靶向分子TyrRGD偶聯(lián)GNPs顆粒，然后GNPs顆粒再偶聯(lián)能促使腫瘤細胞凋亡的VEGFsiRNA而得[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物在VX2兔肝腫瘤組織內(nèi)的聚集性明顯優(yōu)于單純的GNPs顆粒。在注射該復(fù)合物后，RFA對腫瘤的毀損效應(yīng)顯著增強，不僅毀損體積明顯增大，毀損程度更加徹底，且在一定程度上也促進了殘癌細胞的壞死，降低腫瘤轉(zhuǎn)移率，延長動物生存期。該結(jié)果與高勇等[20]報道的Tyr-RGD靶向的siRNA注射入小鼠體內(nèi)24 h后，主要在腫瘤組織內(nèi)分布一致；與Pedro等[21]報道的GNPs-TNFα能增強RFA對腎腫瘤毀損效應(yīng)以及Raskopf等[11]報道的siRNA-VEGF能降低腫瘤微血管密度，抑制體內(nèi)腫瘤生長的結(jié)果基本一致。

TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物同單純的GNPs相比較能好的被腫瘤細胞攝取，可能同以下因素有關(guān)。首先，TyrRGD能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞高表達的αvβ3特異結(jié)合，具有靶向作用[22]；其次，TyrRGD可以促進腫瘤細胞對GNPs顆粒的攝取，并且可以包裹在GNPs表面，防止血清蛋白與其黏附，從而防止聚集[23]；最后，GNPs經(jīng)PEG功能修飾后，其性質(zhì)更加穩(wěn)定，不易聚集成團，同時也增強了細胞對其攝取能力[24-25]。實驗中，TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物組腫瘤毀損體積顯著強于GNPs組和生理鹽水組，而GNPs組同生理鹽水組相比則無統(tǒng)計學(xué)差異，同時，電鏡結(jié)果也表明只在TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物組觀察到GNPs顆粒，而GNPs組則無。這表明單純的GNPs顆粒經(jīng)靜脈血管注射后無法有效的在動物腫瘤中聚集，而TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物中的GNPs顆粒經(jīng)TyrRGD靶向作用及PEG的功能修飾后可有效的到達動物腫瘤部位，從而實現(xiàn)增強RFA毀損效應(yīng)的目的。

眾所周知，索拉非尼可通過抑制包括VEGF在內(nèi)的多個靶點發(fā)揮治療肝癌的作用，GNPs也是良好的藥物載體，理論上GNPs是可以結(jié)合索拉非尼治療肝癌的。不過，在Simon等[26]的研究中，GNPs依靠疏水作用與索拉非尼結(jié)合，其結(jié)合率僅有10%。因此，若用索拉非尼替換復(fù)合物中的VEGFsiRNA發(fā)揮治療肝癌的作用，仍需尋求其與GNPs有效的結(jié)合方式。

本研究初步證實了TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物在增強RFA對VX2兔肝腫瘤損傷效應(yīng)中的積極作用，但是肝臟中VEGF的表達是否被TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA抑制以及TyrRGD-GNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物在動物體內(nèi)分布及代謝情況則缺乏相關(guān)指標(biāo)檢測。對此，在本課題后期研究過程中可以通過Western blot檢測各組中VEGF的表達情況；同時增添裸鼠成瘤模型，通過同位素示蹤法或熒光標(biāo)記法檢測TyrRGDGNPs-VEGFsiRNA復(fù)合物在動物體內(nèi)的整體分布及代謝情況，從而使本研究項目更加完整充實。

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