楊磊+張曼華+蔡虎志+石繼連

摘要：目的 采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定溫陽(yáng)振衰顆粒中人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量。方法 采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～35 min，19%乙腈；35～58 min，19%～29%乙腈；58～70 min，28%乙腈；70～100 min，29%～40%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的進(jìn)樣量分別在0.22～2.2 ?g、0.22～2.2 ?g、0.26～2.6 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8、0.999 8、0.999 1；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的平均回收率分別為98.04%、96.58%、96.75%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為溫陽(yáng)振衰顆粒的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：溫陽(yáng)振衰顆粒；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.019

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）04-0075-04

Content Determination of Ginsenoside Rg1， Ginsenoside Re and Ginsenoside Rb1 in Wenyang Zhenshuai Granules by HPLC YANG Lei1， ZHANG Man-hua2， CAI Hu-zhi1， SHI Ji-lian2 （1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Key Discipline of Processing Chinese Materia Medica of SATCM， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstracts： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 in Wenyang Zhenshuai Granules. Methods The separation was preformed on Agilent TC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 ?m）. The mobile phase consisted of acetonitril-0.05% aqueous solution of phosphoric acid with gradient elution （0–35 min， 19% acetonitrile； 35–58 min， 19%–29% acetonitrile； 58–70 min， 28% acetonitrile； 70–100 min， 29%–40% acetonitrile）. The flow rate was 1.0 mL/min； the wavelength of detector was 203 nm； the temperature of column was 35 ℃. Results The calibration curves showed good linearity in the range of 0.22–2.2 ?g （ginsenoside Rg1， r=0.999 8）， 0.22–2.2 ?g （ginsenoside Re， r=0.999 8） and 0.26–2.6 ?g （ginsenoside Rb1， r=0.999 1）， respectively. The average recoveries of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 were 98.04%， 96.58% and 96.75%， respectively. Conclution The method is accurate， hypersensitized and reproducible， which can be applied to the quality control of Wenyang Zhenshuai Granules.

Key words： Wenyang Zhenshuai Granules； ginsenoside Rg1； ginsenoside Re； ginsenoside Rb1； HPLC

溫陽(yáng)振衰顆粒為湖南省名老中醫(yī)陳新宇教授臨床治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，基于現(xiàn)代中醫(yī)對(duì)慢性心力衰竭病機(jī)的認(rèn)識(shí)，針對(duì)心陽(yáng)虛衰、瘀血停滯、水飲內(nèi)停及痰濁不化，組方由人參、茯苓、甘草等7味藥組成，具有溫陽(yáng)益氣、育陰利尿功效，用于陽(yáng)虛、水泛型慢性心力衰竭，臨床療效確切[1]。前期藥效學(xué)研究表明，該方降低基質(zhì)金屬蛋白酶2和9及改善心功能的作用稍優(yōu)于卡托普利[2]；能上調(diào)信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）蛋白磷酸化的水平，從而激活ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]；可通過(guò)調(diào)節(jié)心力衰竭模型兔心臟功能及降低血漿中內(nèi)皮素-1的含量，以防止和延緩心力衰竭的進(jìn)一步惡化[4]。筆者采用HPLC對(duì)溫陽(yáng)振衰顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進(jìn)行含量測(cè)定，為控制藥品質(zhì)量和制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥endprint

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，LabSolutions數(shù)據(jù)工作站，JH3120型超聲波清洗器（荊州市津?；た萍加邢薰荆琀H恒溫水浴鍋（江蘇金達(dá)中大儀器廠），AE240電子分析天平（METTLER），TD2102型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

溫陽(yáng)振衰顆粒樣品（8 g/袋，批號(hào)20141215、20150109、20150122），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制；人參皂苷Rg1對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)110703-200726）、人參皂苷Re對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)754-9406）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)110704-200921），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為雙重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相A為0.05%磷酸、B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取對(duì)照品人參皂苷Rg1 13.75 mg、人參皂苷Re 13.75 mg、人參皂苷Rb1 16.25 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得人參皂苷Rg1 1.375 mg/mL、人參皂苷Re 1.375 mg/mL、人參皂苷Rb1 1.625 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。再精密吸取混合對(duì)照品貯備液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含人參皂苷Rg1 0.11 mg、人參皂苷Re 0.11 mg、人參皂苷Rb1 0.13 mg的混合對(duì)照品溶液。 2.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取缺人參的陰性樣品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液及供試品溶液各10 ?L，分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置無(wú)相應(yīng)的色譜峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2、5、10、15、20 ?L，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。人參皂苷Rg1 Y=7.7×105X-19 957，r2=0.999 8；人參皂苷Re Y=7.7×105X-17 605，r2=0.999 8；人參皂苷Rb1 Y=4.6×105X+24 235，r2=0.999 1。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在0.22～2.2 ?g、人參皂苷Re在0.22～2.2 ?g、人參皂苷Rb1在0.26～2.6 ?g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，精密吸取10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.61%、1.00%、1.12%，表明該方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 ?L，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為0.69%、0.58%、1.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)20141215）的內(nèi)容物，研細(xì)，取6份，每份約2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品含量，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量分別為0.723、0.801、0.570 mg/g，RSD分別為1.02%、1.33%、1.09%，表明本方法重復(fù)性好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的溫陽(yáng)振衰顆粒（人參皂苷Rg1 0.703 mg/g、人參皂苷Re 0.818 mg/g、人參皂苷Rb1 0.576 mg/g）共6份，每份2 g，分別準(zhǔn)確加入1.375 mg/mL人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液1 mL、1.375 mg/mL人參皂苷Re對(duì)照品溶液1.2 mL、1.625 mg/mL人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液0.7 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 ?L注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

2.11 樣品測(cè)定

取3批溫陽(yáng)振衰顆粒，每批平行做2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算溫陽(yáng)振衰顆粒樣品中3種人參皂苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

人參為溫陽(yáng)振衰顆粒中的君藥，有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、安神益智的功效，用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛咳喘等?，F(xiàn)代研究表明，人參有較強(qiáng)的抗心律失常[5]、抗休克[6]和心肌細(xì)胞保護(hù)作用[7-8]。因此，本研究采用HPLC對(duì)溫陽(yáng)振衰顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進(jìn)行測(cè)定，以3種皂苷含量為指標(biāo)，建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法。endprint

本試驗(yàn)考察了Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）和YWG-C18（250 mm×4.6 mm，10 ?m）2個(gè)品牌2種長(zhǎng)度色譜柱的分離效果，結(jié)果表明Agilent TC-C18色譜柱在分離效果和柱壓方面都優(yōu)于YWG-C18柱，故選用Agilent TC-C18色譜柱進(jìn)行分析。在樣品處理方面，分別考察了萃取法、中性氧化鋁柱層析法及D101大孔吸附樹(shù)脂法，結(jié)果表明，萃取法對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的選擇性高、專屬性好，注入高效液相色譜儀后分離效果好，適合用于含量測(cè)定，故選用萃取法進(jìn)行供試品溶液的制備。在色譜條件方面，分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-水等不同的梯度洗脫流動(dòng)相，最終選用乙腈-0.05%磷酸進(jìn)行分離，各被測(cè)成分分離良好且峰形較佳。流動(dòng)相為28%乙腈（35～58 min）時(shí)，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度不好，經(jīng)過(guò)對(duì)大量條件進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)將乙腈19%～28%（35～58 min）梯度調(diào)整為乙腈19%～29%（35～58 min），可使部分干擾峰提前出峰，達(dá)到含量測(cè)定要求。柱溫35 ℃時(shí)色譜峰的分離度優(yōu)于30 ℃和25 ℃。

本研究建立的HPLC方法能簡(jiǎn)便高效地同時(shí)對(duì)溫陽(yáng)振衰顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)多批供試品驗(yàn)證，重復(fù)性好，結(jié)果表明該方法可用于溫陽(yáng)振衰顆粒的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1] 尹玲瓏，陳新宇，蔡虎志，等.溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)慢性心力衰竭陽(yáng)虛水泛證患者臨床療效及血管內(nèi)皮功能的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014， 34（4）：20-23.

[2] 閆紅，陳新宇，盧青，等.溫陽(yáng)振衰方對(duì)慢性心衰模型大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶2，9的影響[J].光明中醫(yī)，2013，28（7）：1336-1339.

[3] 陳新宇，蔡虎志，史微，等.溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰兔心肌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014， 34（1）：14-18.

[4] 劉尚，蔡虎志，唐燕萍，等.溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)慢性充血性心力衰竭模型兔心臟功能及內(nèi)皮素-1的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2013，29（12）：123- 125.

[5] 劉遠(yuǎn)林.人參對(duì)慢性心力衰竭心室重構(gòu)及6min步行試驗(yàn)的影響[C]// 中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì).中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編.北京：中華醫(yī)學(xué)會(huì)雜志社，2008：380-381.

[6] 于震，韓淑燕，李海霞，等.人參和紅花提取物配伍對(duì)心肌缺血犬心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18（7）：777-782.

[7] 吳紅金，劉宇娜.人參皂甙Rg1抑制60Co照射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（21）：3332-3334.

[8] 吳紅金，劉宇娜.人參皂甙Re對(duì)60Co照射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（8）：923-924.endprint