吳 茵，魏 欣，劉洪濤，董占軍

玄麥甘桔中指標性成分血藥濃度的UPLC-MS/MS法測定及藥代動力學研究

吳 茵，魏 欣，劉洪濤，董占軍*

目的 建立玄麥甘桔顆粒中指標性成分甘草苷和哈巴俄苷在大鼠血漿中的超高效液相-質譜/質譜定量測定方法，并研究其體內藥動學過程。方法 色譜柱：菲羅門Kinetex C18柱(50 mm×3 mm，2.6 μm)；柱溫：20 ℃；流動相為0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；進樣量：5 μL。采用ESI源，多反應監(jiān)測模式(MRM)負離子模式下檢測各成分血藥濃度。6只雄性大鼠灌胃玄麥甘桔顆粒藥液后分別于給藥后0.03、0.08、0.16、0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h，眼內眥取血0.5 mL測定血藥濃度，并用DAS 3.0 軟件計算藥動學參數。結果 以蘆丁為內標，甘草苷、哈巴俄苷的檢測范圍分別為0.78～50.0 ng/mL(r=0.997 9)和1.66～106.10 ng/mL(r=0.995 8)。方法回收率>82.3%，日內精密度與日間精密度RSD均<8.8%。甘草苷、哈巴俄苷大鼠體內的t1/2分別為(3.46±2.08)、(3.28±1.17)h，Cmax分別為(27.55±21.12)、(16.28±14.53)μg/L，tmax分別為(0.31±0.19)、(0.33±0.18)h，AUC0～12 h分別為(48.82±11.35)、(64.85±46.70)μg ·h/L。結論 該方法快速、靈敏，重復性好，可用于玄麥甘桔顆粒2種指標性成分在大鼠體內的藥代動力學研究。

玄麥甘桔顆粒；甘草苷；哈巴俄苷；超高效液相色譜-質譜/質譜；藥動學

0 引言

玄麥甘桔顆粒是2015年版藥典的載入品種，由玄參、麥冬、甘草、桔梗4味藥材組方，具有祛痰利咽、滋陰養(yǎng)肺之功。方中以玄參為君，清熱涼血、滋陰解毒；以麥冬為臣，養(yǎng)陰潤肺、益胃生津；佐以桔?；敌?，使以甘草調和諸藥、祛痰止咳。該藥臨床應用廣泛，主要用于治療陰虛火旺所致的咳嗽、咽炎等呼吸道系統(tǒng)疾病[1-2]。哈巴俄苷為玄參的主要有效成分，有抗炎、抗氧化的作用[3]；甘草中的甘草苷在抗病毒、抑制潰瘍方面有較強的生物活性[4]。這些成分既是玄麥甘桔顆粒的物質基礎，也是質量控制常用的指標性成分[5]。

目前，國內學者對該藥的研究主要集中在含量測定和質量控制，而尚未見該藥入血活性成分的藥代動力學研究報道。中藥復方制劑成分復雜，藥代動力學代謝特點獨特。本文首次建立了大鼠灌胃玄麥甘桔顆粒后血漿中甘草苷及哈巴俄苷的UPLC-MS/MS法。該方法靈敏度高、可操作性強，為該藥的物質基礎研究和臨床應用提供了理論依據。

1 儀器、試藥與動物

AB Sciex QTRAPTM 5500型三重四極桿質譜儀，美國Applied Biosystems公司，含有Turbo V離子源和三重四極桿質量分析器。超高效液相色譜系統(tǒng)，Shimadzu 30A UPLC System，Kyoto，日本，配有Shimadzu 30AD二元高壓梯度泵、Shimadzu SIL30AC自動進樣器和Shimadzu CTO30AD柱溫箱，Analyst 1.6.1數據采集軟件。BP211D型分析天平，德國Sartorius公司；雷勃爾LG16-B高速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司。

對照品哈巴俄苷(批號:20141015)、甘草苷(批號:20140923)購自南京春秋生物科技有限公司，純度均>98%。乙腈、甲酸為色譜純，水為娃哈哈純凈水。玄麥甘桔顆粒由藥店購得，規(guī)格：10 g/袋，批號：51078，寧夏多維藥業(yè)有限公司生產。

清潔級SD(Spraque-Dawley)大鼠，體重200～250 g，雄性(河北省實驗動物中心提供，合格證編號:1508018號)。實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境：溫度23～25 ℃；相對濕度50%±5%。給藥前12 h禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 檢測條件 液相條件：色譜柱為菲羅門Kinetex C18柱(50 mm×3 mm,2.6 μm)；柱溫20 ℃；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～6 min，10%～60%乙腈；6～6.1 min，60%～10%乙腈；體積流量0.3 mL/min；進樣量5 μL；進樣前平衡2 min。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI源)，離子源溫度為600 ℃，負離子模式監(jiān)測。離子源電壓為-4 500 V，霧化氣(gas 1)和加熱氣(gas 2)分別為414、448 kPa，氣簾氣為172 kPa，采用負離子模式掃描模式監(jiān)測，甘草苷和哈巴俄苷的去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)分別為-100 V、-28 V，-110 V、-14 V；檢測離子對分別為m/z 417.1/255.0、m/z 493.2/345.2，內標蘆丁的去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)分別為：-90 V、-24 V；檢測離子對為m/z 609.1/300.0。

2.2 血漿樣品的制備 取內標溶液20 μL于離心管中，40 ℃水浴下氮氣吹干，備用。精密吸取大鼠血漿200 μL，置于離心管中，渦流混旋1 min；再加入400 μL乙腈，混旋2 min，以14 000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，氮氣流吹干。殘渣加入10%乙腈100 μL復溶，渦流混旋1 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL進UPLC-MS/MS分析，記錄色譜圖。

2.3 標準曲線和質控樣品的制備 分別精密稱取2種待測成分對照品適量，定量溶解于甲醇作為儲備液。分別精密量取上述各儲備液適量至同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成混合對照品溶液。取混合對照品溶液和內標各20 μL加入離心管氮氣吹干后，再將200 μL空白血漿加入其中，按“2.2”項下方法處理，制得系列甘草苷含量為0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.0 ng/mL，哈巴俄苷為1.66、3.31、6.63、13.26、26.53、53.05、106.10 ng/mL的標準樣品；內標蘆丁的濃度為17.5 ng/mL。同法配制低、中、高3種濃度的標準溶液[甘草苷(1.56、6.25、40.00 ng/mL)，哈巴俄苷(3.31、13.26、84.88 ng/mL)]，作為質控(QC)樣品。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 通過比較空白血漿、模擬生物樣品和灌胃給藥后的實際生物樣品發(fā)現(xiàn)，被測物和內標不受血漿內源性物質和代謝產物的干擾，見圖1。

2.4.2 線性關系考察 按“2.3”項下方法處理，記錄各被測物系列濃度色譜圖，以甘草苷、哈巴俄苷與內標物峰面積比值對甘草苷、哈巴俄苷質量濃度進行線性回歸，回歸方程分別為Y=0.194 X-0.059 2 (r=0.997 9)和Y=0.011 X-0.003 78 (r=0.995 8)。結果表明,甘草苷、哈巴俄苷血藥濃度分別在0.78～50.00、1.66～106.10 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.4.3 提取回收率和基質效應 取空白血漿200 μL，分別制備低、中、高3種濃度的含藥QC樣品，按“2.5”項下操作，進樣分析，記錄峰面積，每一濃度平行測定5份，記錄待測物和內標的峰面積比值為A；另取空白血漿200 μL，按“2.2”項下操作處理后，加入對應的低、中、高3種濃度的標準系列溶液進樣分析，記錄待測物和內標的峰面積比值為B，每一濃度平行測定5份；A/B×100%即得提取回收率。另用初始比例流動相將標準系列溶液配制成與上述理論濃度相同的低、中、高3種濃度溶液直接進樣分析，每一濃度平行測定5份，記錄待測物和內標的峰面積比值為C，基質效應的計算方法為 B/C×100%。甘草苷和哈巴俄苷低、中、高3種濃度的回收率和基質效應見表2。內標的回收率和基質效應分別為91.4%和87.2%。結果表明，所建方法能夠滿足生物樣品的測定要求。

圖1 大鼠血漿中2種指標成分的MRM提取離子流圖

表2 2種成分的提取回收率和基質效應(n=5)

2.4.4 精密度與準確度 取空白血漿，按“2.3”項下方法制備高、中、低3個濃度的QC樣品各6份，測定并計算2種待測成分與內標的峰面積比，用當日隨行的標準曲線計算QC樣品的測定濃度，考察方法的日內精密度和準確度。連續(xù)測定3 d，考察日間精密度和準確度，RSD均<15%，結果見表3。

表3 2種成分的精密度和準確度(%)

2.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法制備含甘草苷和哈巴俄苷低、中、高3種濃度的含藥血漿QC品，考察上述2種成分血漿樣品反復凍融3次、-20 ℃放置15 d、室溫放置4 h以及經“2.3”方法處理后的分析物放置12 h的穩(wěn)定性，被測物濃度變化在85%～115%，結果表明，甘草苷和哈巴俄苷上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 藥代動力學試驗 雄性SD大鼠6只，給藥前12 h禁食，自由飲水。取玄麥甘桔顆粒，外標法測定，甘草苷和哈巴俄苷的含量分別為107.2 μg/g和28.7 μg/g。用適量水溶解，按1 g/mL配成灌胃液，并以8 mL/kg的劑量灌胃給予玄麥甘桔顆粒水溶液，分別于給藥后0.03、0.08、0.17、0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h，眼內眥取血0.5 mL，放在肝素化離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取上層大鼠血漿冷凍于-20 ℃冰箱中。按“2.2”項下同法操作，記錄各待測物與內標的峰面積比，用當日的標準曲線計算甘草苷、哈巴俄苷的濃度，并繪制藥-時曲線(見圖2)，采用DAS 3.0計算各物質藥代動力學參數，主要藥代動力學參數見表4。

圖2 甘草苷和哈巴俄苷的藥時曲線圖

藥動學指標參數值甘草苷哈巴俄苷Cmax(ng/mL)27.55±21.1216.28±14.53tmax(h)0.31±0.190.33±0.18t1/2(h)3.46±2.083.28±1.17AUC0～t(ng·h/mL)48.82±11.3564.85±46.70AUC0～∞(ng·h/mL)54.17±16.3169.82±48.27

3 討論

本實驗分別考察了常用流動相甲醇-水、乙腈-水和乙腈-甲酸水，結果發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.1%甲酸水體系作為流動相時，被分析成分分離效果好，峰形對稱。對加入水相的甲酸比例進一步進行考察，結果表明，水相中加入0.1%甲酸能夠達到良好的分離效果和穩(wěn)定的響應值，最后采用0.1%甲酸-乙腈水溶液為流動相進行梯度洗脫。

在樣品處理過程中，本實驗分別比較了蛋白沉淀(PP)和液-液萃取(LLE)2種前處理方法。分別采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚為萃取試劑進行液-液萃取，發(fā)現(xiàn)方法回收率較低，且處理過程復雜。蛋白沉淀法操作簡單，重現(xiàn)性好。本實驗對不同的蛋白沉淀劑如甲醇、乙腈等分別進行考察，結果顯示，采用乙腈作為蛋白沉淀劑，提取效率高，操作方便，且得到的樣品內源性干擾較少。

藥代動力學結果顯示，大鼠灌胃玄麥甘桔顆粒后，甘草苷和哈巴俄苷的達峰時間分別為0.31、0.33 h；消除半衰期分別為3.46、3.28 h；說明玄麥甘桔顆粒后這些成分入血吸收和消除都較為迅速。與文獻[6-7]相比，玄麥甘桔顆粒中這2種被測物的藥動學行為與其單一成分、單味藥材或復方配伍中的不同，這可能由于復方中藥體系中多種組分相互作用所致。復方中藥制劑的藥代動力學特點不同于單一成分或單味藥材的藥代動力學，反映了復雜中藥體系中多種組分相互作用的結果。因此，玄麥甘桔顆粒的藥代動力學研究為明確該藥的作用機制、揭示配伍的合理性和臨床應用有重要的意義。

[1] 李方.玄麥甘桔湯治療咽炎性咳嗽30例[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,10(8):90-92.

[2] 唐華平,郝月琴,王宏,等.加味玄麥甘桔湯治療咳嗽變異性哮喘100例臨床觀察[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(10):64-65.

[3] 許福泉,許旭東,陳士林.玄參化學成分及藥理活性研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥,2013,15(9):752-759.

[4] 高雪巖,王文全,魏勝利,等.甘草及其活性成分的藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志,2009,34(21):2695-2700.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[6] 趙瑞芝,王銀潔,馮麗敏,等.大鼠口服芍苓消銀片后血液中芍藥苷、落新婦苷、迷迭香酸、異嗪皮啶、甘草苷的藥物動力學研究[J].中國中藥雜志,2014,39(13):2559-2563.

[7] 徐多多,龐歡歡,江美芳,等.玄參提取物化學成分及其大鼠血漿移行成分的LC-LTQ-Orbitrap分析[J].中國中藥雜志,2016,41(3):521-527.

Determination of plasma concentration of indicative components in Xuanmai ganjie granules by UPLC-MS/MS and their pharmacokinetic study

WU Yin,WEI Xing,LIU Hong-tao,DONG Zhan-jun*

(Department of Pharmacy,Hebei General Hospital,Shijiazhuang 050051,China)

Objective To establish a UPLC-MS/MS method for the determination of indicative components such as liquiritin and harpagoside in Xuanmai ganjie granules in rats′ plasma,and to study the pharmacokinetics of them.Methods Phenomenex Kinetex C18column(50 mm×3 mm，2.6 μm)was used,and the column temperature was 20 ℃.The chromatography was eluted with mobile phase consisting of 0.1% formic acid solution(A) and acetonitrile(B) at the flow rate of 0.3 mL/min by gradient elution,the volume was 5 μL.Multiple-reaction monitoring (MRM) scanning mode was employed for quantification with switching electrospray ion(ESI) source polarity in negative mode.Six SD male rats were docked to collect blood 0.5 mL from angular vein at 0.03,0.08,0.16,0.33,0.67,1,1.5,2,3,4,6,8 and 12 h after administration of Xuanmai ganjie granule solution to determine the blood concentration of drugs.The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 3.0 software.Results The linear ranges of liquiritin and harpagoside were 0.78～50.00 ng/mL (r=0.997 9) and 1.66～106.10 ng/mL (r=0.995 8),respectively.The intra-dayRSDand inter-dayRSDwere all lower than 8.8%,and the average recoveries were more than 82.3%.The pharmacokinetic parameters of liquiritin and harpagoside were as follows:t1/2:(3.46±2.08) and (3.28±1.17)h,Cmax:(27.55±21.12) and (16.28±14.53)μg/L,tmax:(0.31±0.19) and (0.33±0.18)h,AUC0～12 h:(48.82±11.35)and (64.85±46.70)μg·h/L.Conclusion The method is efficient,sensitive and reproducible,and can be used for pharmacokinetic analysis of liquiritin and harpagosideinvivo.

Xuanmai ganjie granules;Liquiritin;Harpagoside;UPLC-MS/MS;Pharmacokinetic

2016-08-09

河北省人民醫(yī)院藥學部,石家莊 050051

河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(ZL20140340)；河北省中醫(yī)藥管理局指導性項目(2014152)

10.14053/j.cnki.ppcr.201703022

*通信作者