李鳳玉，賈勝男，馬 爽，趙洪巖，霍洪亮

(東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024)

人參皂苷Rg1抑制C2C12細胞MuRF-1/Atrogin-1表達研究

李鳳玉，賈勝男，馬 爽，趙洪巖，霍洪亮

(東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024)

采用MTT、流式細胞術和western blot 檢測人參皂苷Rg1對C2C12細胞活力、細胞凋亡、泛素連接酶E3表達的影響，并進一步研究了Rg1發(fā)揮作用的相關機制。結果表明，Rg1抑制細胞中MuRF-1 /Atrogin-1的表達，并激活AKT使FoxO1/3a磷酸化，從而抑制MuRF-1 /Atrogin-1表達，Rg1的作用能被PI3K抑制劑LY294002所抑制。以上結果說明：Rg1對C2C12細胞具有抗細胞凋亡和蛋白質降解的作用，可為人參皂苷Rg1在臨床肌萎縮的治療和預防提供新的思路和方法。

Rg1；肌萎縮；PI3K/AKT；FoxO

肌肉萎縮是指骨骼肌營養(yǎng)障礙或肌纖維變細甚至消失等導致的肌肉體積縮小。肌肉萎縮患者由于肌無力而長期臥床誘發(fā)多種并發(fā)癥，給患者生命和生活質量帶來極大的威脅[1]。骨骼肌屬于終末分化細胞，不能繼續(xù)進行有絲分裂。因此，肌組織的可塑性是通過分裂后調控實現(xiàn)的，主要通過改變蛋白質的合成率與降解率來對骨骼肌的生理功能進行調節(jié)[2-4]。通常情況下，蛋白質的代謝處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當?shù)鞍踪|的降解明顯快于合成時，蛋白質總量就會出現(xiàn)凈損失，導致骨骼肌萎縮[5]。引起肌肉萎縮的病因十分復雜，但都以激活細胞內蛋白降解酶為前提，其中起主要作用的是ATP依賴的兩種肌肉特異性泛素連接酶E3 MuRF-1和Atrogin-1，它們在肌肉萎縮時高度表達，執(zhí)行蛋白質降解的功能[6-8]。MuRF-1和Atrogin-1的基因表達受叉頭框轉錄因子FoxO家族蛋白FoxO1和FoxO3a的調控。因此，通過PI3K/AKT途徑使叉頭框轉錄因子FoxO磷酸化，抑制其轉錄活性，進而抑制兩種泛素連接酶E3的表達，可能成為抗肌肉萎縮研究和藥物開發(fā)的重要靶點。

人參具有顯著的強身健體功能，關于人參皂苷Rg1緩解疲勞、延緩衰老和改善學習記憶等作用已有大量研究報道[9-10]。但關于人參皂苷Rg1抗肌肉萎縮方面還鮮有報道。本文利用饑餓法培養(yǎng)小鼠肌母細胞系C2C12，制作肌肉萎縮模型[11-16],研究Rg1抗肌肉萎縮的功能和作用機制，為開發(fā)安全有效抗、無副作用的抗肌肉萎縮藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；MTT、Tris、甘氨酸、SDS、過硫酸銨、PI3K抑制劑LY294002(美國sigma公司)；單克隆抗兔AKT、p-AKT、FoxO1、p-FoxO1、FoxO3a、p-FoxO3a抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；單克隆抗兔MuRF-1、Atrogin-1抗體(美國Abcom公司)；單克隆抗體鼠β-actin和 ECL蛋白印跡試劑盒(美國Santa Cruz公司)；HEPES、碳酸氫鈉、胰蛋白酶、甘油、β-巰基乙醇、二甲基亞砜(DMSO)和胎牛血清(FBS)、EDTA、人參皂苷Rg1(北京鼎國生物公司)；青霉素-鏈霉素溶液-雙抗(中國碧云天公司)；cAMP ELISA試劑盒(美國RD公司)；細胞板96孔板、6孔板、載玻片、蓋玻片、抗體孵育盒、脫脂奶粉、牛血清白蛋白、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、抗體稀釋液、PMSF蛋白酶抑制劑(長春尚寶生物公司)；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)(上海碧云天生物技術有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.2 細胞系

小鼠骨骼肌細胞系C2C12購買于美國模式菌種收集中心(ATCC)。

1.3 MTT檢測細胞活性

收集生長狀態(tài)良好的C2C12，取200 μl以1×104個/ml接種至96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞完全貼壁后，吸棄培養(yǎng)基；分組處理：對照組、無血清培養(yǎng)基組、無血清培養(yǎng)基加Rg1共孵育組，Rg1分為10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM 4個濃度；處理48 h后，加入20 μl MTT溶液(終濃度為0.5 mg/ml), 再孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基；每孔再加150 μl DMSO，搖床震蕩10 min，使孔中殘留的 MTT-甲臜結晶充分溶解，酶標儀490 nm 檢測OD值。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取C2C12細胞2 ml以1×106個/ml接種到6孔板，加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分組處理：對照組、無血清培養(yǎng)基組、無血清培養(yǎng)基加Rg1(10-2mM)共孵育組；72 h后棄上清，用0.25%胰蛋白酶消化收集，用PBS清洗細胞兩次，2000 rps離心 5 min，收集1×105～5×105個細胞。加100 μl Binding Buffer，懸浮細胞，適宜力度吹打均勻。加50 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后再加入50 μl PI，吹打混勻，室溫避光，反應15 min。在1 h 內利用流式細胞儀進行觀察和檢測。激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長530 nm。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

建模后的C2C12細胞經(jīng)預冷的PBS漂洗2次,加入1 ml預冷的RIPA裂解液, 在RIPA裂解液中加入PMSF(終濃度1 mM)。靜置1 min，吹打均勻，將裂解液轉移至預冷的EP管中，冰上裂解30 min。4℃ 12000 rpm離心10 min，取上清液100 μl，轉移至新EP管中，即為提取的蛋白樣, -20 ℃保存?zhèn)溆?。在每個蛋白樣品中加入等體積SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，沸水煮5～10 min使蛋白變性。上樣，120 V電泳。電泳結束后，用蒸餾水沖洗凝膠1 min。PVDF膜用甲醇均勻潤濕3 min。將凝膠、2張海綿、6張濾紙置于轉膜液中浸潤平衡15 min。取出轉移夾，從負極到正極依次平放1張海綿、3張濾紙、凝膠、1張PVDF膜、3張濾紙、1張海綿，制成轉移“三明治”。恒壓150 V轉移1 h。轉膜結束后，取出PVDF膜，將膜放入封閉液室溫水平搖床封閉1 h，一抗4 ℃過夜。TBST室溫脫色搖床漂洗3次，每次8 min。加入二抗，室溫搖床上緩慢搖動1 h。再加入TBST，脫色搖床漂洗3次，每次8 min。用ECL蛋白印跡試劑盒在全自動顯影儀中顯影。使用Image Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，應用Sigma plot 10.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學分析采用樣本平均數(shù)t檢驗進行各組間數(shù)值比較，P< 0.05為顯著差異。

2 實驗結果

2.1 Rg1提高細胞活力并抑制細胞凋亡

圖1為Rg1共孵育C2C12細胞48 h后，MTT法檢測490 nm 吸光值。con表示對照組；SF表示無血清培養(yǎng)組；10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM分別表示無血清+此濃度Rg1共孵育組。與對照組相比，無血清培養(yǎng)48 h后，細胞活力明顯下降，僅相當于對照組的56%，Rg1共孵育后，低濃度組(10-4mM)細胞活力明顯提高，并且隨著Rg1濃度的升高，OD值隨之增大，當Rg1濃度達到10-1mM時，OD值達到最大值，恢復至與對照組相近水平。流式細胞儀檢測結果如圖2所示。由圖可見，與對照組相比，饑餓組細胞凋亡率由10.36%升高到83.4%。與Rg1共孵育后，細胞凋亡率下降到32.22%。通過以上結果，可以說明Rg1對C2C12細胞具有提高細胞活力并抑制細胞凋亡的作用。

圖1 Rg1對C2C12細胞凋亡的影響

圖2 Rg1對C2C12細胞活力影響

2.2 Rg1抑制泛素連接酶E3的表達

泛素連接酶E3是調節(jié)泛素蛋白酶降解蛋白質誘發(fā)肌肉萎縮的主要原因之一。抑制泛素連接酶E3是治療和預防肌萎縮的關鍵。本文檢測了Rg1對無血清培養(yǎng)C2C12細胞中兩種特異性泛素連接酶E3即MuRF-1和Atrogin-1表達的影響。圖3a為Western blot檢測Rg1共孵育C2C12細胞對肌肉特異性泛素連接酶MuRF-1的表達的影響。圖3b為Western blot檢測Rg1共孵育C2C12細胞對肌肉特異性泛素連接酶Atrogin-1的表達的影響。con表示對照組；SF表示無血清培養(yǎng)組；10-4mM、10-3mM、10-2mM、10-1mM分別表示無血清+此濃度Rg1共孵育組(#P<0.05 Vs con; *P<0.05 Vs SF; n=7)。實驗結果顯示，與對照組相比，無血清培養(yǎng)組MuRF-1和Atrogin-1的表達明顯升高，Rg1共孵育組(10-2mM)能較好地抑制Atrogin-1和MuRF-1的表達，并呈劑量依賴性。說明Rg1能夠抑制泛素連接酶的表達。Rg1濃度大于10-2mM時，抑制作用不明顯。

2.3 Rg1調節(jié)PI3K依賴的AKT/FoxO1/3a信號通路

FoxO1和FoxO3a是調控MuRF-1和Atrogin-1表達的轉錄因子，Western blot方法檢測Rg1抑制泛素連接酶E3轉錄因子FoxO1/3a的活性,結果見圖4。Rg1(10-2mM)孵育C2C12細胞60 min后，F(xiàn)oxO1和FoxO3a磷酸化水平明顯升高。PI3K特異性抑制劑LY294002能明顯抑制Rg1對FoxO1和FoxO3a產生的磷酸化效應。說明Rg1對FoxO1和FoxO3a兩種轉錄因子活性的影響與PI3K/AKT信號通路關系密切。繼續(xù)檢測Rg1是否激活PI3K/AKT信號通路。結果顯示,Rg1孵育C2C12細胞，AKT的磷酸化水平逐漸升高，60 min磷酸化水平最為顯著(圖5)。PI3K特異性抑制劑LY294002預孵育C2C12細胞1 h后, 再重復以上實驗，AKT的磷酸化水平顯著下降，基本與對照組的磷酸化水平持平(圖4)。說明Rg1激活了PI3K依賴的AKT信號通路。

圖3 Rg1對MuRF-1 和Atrogin-1表達的影響

圖4 Rg1(10-2mM)對FoxO1和FoxO3a磷酸化的影響

圖5 Rg1(10-2mM)共孵育在不同時間梯度下對AKT磷酸化的影響

3 討論

蛋白質大量降解引起肌肉萎縮。目前已經(jīng)確定在不同程度上參與蛋白質降解過程的蛋白降解酶系統(tǒng)有5類，它們分別是：泛素蛋白酶水解系統(tǒng)、鈣離子依賴性蛋白酶系統(tǒng)、鈣獨立組織蛋白酶L系統(tǒng)、自噬系統(tǒng)和半胱天冬酶系統(tǒng)。其中，泛素蛋白酶系統(tǒng)是肌肉萎縮調節(jié)蛋白質降解的關鍵酶系，也是諸多其它分解代謝過程中蛋白質降解的共同途徑。在關于肌肉萎縮的報道中，小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12被廣泛應用于細胞模型中，因此本文也以C2C12細胞為實驗材料。另外，肌肉萎縮常與營養(yǎng)缺乏或營養(yǎng)吸收障礙等機體虛弱有關，因此本實驗采用無血清培養(yǎng)細胞的饑餓處理方法建立細胞損傷模型。目前中醫(yī)治療肌萎縮有明顯的臨床優(yōu)勢，本實驗選用了人參的主要活性成分人參皂苷Rg1作用于無血清培養(yǎng)的C2C12細胞，檢測Rg1對受損C2C12細胞的保護作用。

本實驗分析了無血清培養(yǎng)和Rg1對C2C12細胞活性的影響。無血清培養(yǎng)使細胞活性明顯下降，隨著Rg1孵育濃度增加，細胞活性逐漸升高，當Rg1濃度為10-1mM時，細胞活性最強。細胞凋亡與肌細胞中蛋白質降解密切相關，JM Argilés研究指出，在骨骼肌處于損耗性的分解代謝水平時，凋亡信號至關重要并先于蛋白質降解發(fā)生，已證明有很多不同的凋亡介質參與其中[17]，也就是說凋亡信號對骨骼肌蛋白質降解的激活十分必要。抑制細胞凋亡的物質，也可以成為治療肌萎縮的潛在藥物，實驗觀察到Rg1能明顯抑制無血清培養(yǎng)引起C2C12細胞的凋亡現(xiàn)象。

通過觀察Rg1對C2C12細胞的保護作用，我們推測Rg1有可能通過抑制泛素蛋白酶途徑發(fā)揮作用，本實驗檢測了Rg1對泛素連接酶E3表達的影響。發(fā)現(xiàn)與預測的實驗結果相一致，Rg1抑制了兩種肌肉特異性泛素連接酶E3的表達，Rg1濃度為10-2mM時，足以使兩種泛素連接酶的表達量最低，說明在一定濃度范圍內，Rg1可以抑制E3的表達。

AKT是PI3K啟動細胞生存信號的一個重要的下游介質，AKT失活叉頭框轉錄因子FoxO1/3a的信號通路在許多研究肌蛋白降解的文章報道，F(xiàn)oxO1/3a是泛素連接酶E3的轉錄因子，因此PI3K/AKT途徑是抗蛋白水解的關鍵信號通路。因此，本文探究了Rg1抑制泛素蛋白酶活性作用是否與PI3K/AKT途徑和重要分子介質FoxO1/3a有關。結果顯示Rg1單獨處理組與對照組相比，可以明顯激活AKT的磷酸化和FoxO的磷酸化，當Rg1與PI3K特異性抑制劑LY294002共處理時，Rg1所有作用都受到了抑制。說明Rg1的作用都是通過PI3K/AKT介導的。

4 結論

人參皂苷Rg1一方面通過激活PI3K/AKT途徑，失活相關轉錄因子如FoxO1/3a，抑制泛素連接酶E3即MURF-1和Atrogin-1的基因表達，進而抑制小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12細胞的凋亡和蛋白質降解，提高細胞活性和生理功能。另一方面通過PI3K/AKT途徑激活了相關蛋白酶mTOR的磷酸化，使mTOR活性提高，進而參與小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12細胞的抗凋亡抗蛋白質降解等多種生理過程。

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Research on Ginsenoside Rg1 Inhibits MuRF-1 /Atrogin-1 Expression in C2C12 Cells

LI Feng-yu, JIA Sheng-nan; MA Shuang, ZHAO Hong-yan, HUO Hong-liang

(School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun Jilin 130024, China)

The effects of ginsenoside Rg1 on cell viability, apoptosis, expression of ubiquitin ligase E3 in C2C12 cells were detected by MTT, flow cytometry and western blot, and the mechanism of Rg1’s action was further studied. The results showed that Rg1 inhibited the expression of MuRF-1 / Atrogin-1, and activated AKT to phosphorylate FoxO1/3a, thus inhibiting the expression of MuRF-1 / Atrogin-1. The function of Rg1 can be inhibited by PI3K inhibitor LY294002.These results indicate that Rg1 has anti-apoptotic and protein degradation effects on C2C12 cells, providing a new idea and method for ginsenoside Rg1 in the treatment, prevention and prognosis evaluation of clinical muscular atrophy.

Rg1; muscle atrophy; PI3K / AKT; FoxO

2016-08-10

國家自然科學基金項目“雌激素降解工程菌的構建與代謝調控機制研究”(51478096)；吉林省重點科技攻關項目“人參皂苷護眼液研發(fā)”(20140204059YY)。

李鳳玉(1989- ),女，碩士研究生，從事細胞抗凋亡機制研究。

霍洪亮(1963- )，男，教授，碩士生導師，博士，從事分子細胞生理學研究。

Q445

A

2095-7602(2017)02-0065-06