萬一方，葉思言，段淑琪，杜聲杰，阮馨慰，許美玉

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚誘導(dǎo)的免疫毒性

萬一方，葉思言，段淑琪，杜聲杰，阮馨慰，許美玉

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

3-甲基-4-硝基苯酚(PNMC)是重要的汽車尾氣有效活性成分，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有免疫毒性作用。作為食物多酚類物質(zhì)，原花青素具有抑制各種毒性作用，而葡萄籽富含原花青素。用細(xì)胞活力分析和ELISA實(shí)驗(yàn)，研究葡萄籽原花青素對(duì)PNMC免疫毒性影響結(jié)果表明：葡萄籽原花青素顯著抑制PNMC對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的毒性作用，緩解PNMC對(duì)脾T淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2、4及顆粒酶B功能的損傷作用。測(cè)定OH·、SOD、GSH-Px 和MDA指標(biāo)的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明：葡萄籽原花青素緩解PNMC對(duì)脾淋巴細(xì)胞的免疫毒性作用與其抗氧化作用具有密切關(guān)系。

葡萄籽原花青素；3-甲基-4-硝基苯酚；緩解免疫毒性；脾淋巴細(xì)胞

機(jī)動(dòng)車尾氣排放已經(jīng)成為我國大中城市空氣污染的重要來源之一，柴油車尾氣顆粒的有效成分硝基苯酚類物質(zhì)PNMC，不僅可以改變大鼠血液中生化指標(biāo)，降低血液中的白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的數(shù)量[1]，而且對(duì)大鼠的脾臟的重量及脾T淋巴細(xì)胞的數(shù)量都具有選擇性影響[2]。脾淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞和B細(xì)胞，T細(xì)胞通過產(chǎn)生及釋放白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和顆粒酶B(granzyme-B)等細(xì)胞因子來發(fā)揮其免疫作用。PNMC不僅抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，也影響脾T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[3]。有研究表明，具有抗氧化作用的物質(zhì)，能夠降低機(jī)動(dòng)車尾氣造成的機(jī)體損害[4]。

我國葡萄資源較為豐富，而大多數(shù)的葡萄用于釀酒。工業(yè)酒的生產(chǎn)伴隨著大量的垃圾，每年生產(chǎn)出數(shù)以萬噸計(jì)釀酒葡萄廢棄物，其中主要包括葡萄皮、葡萄籽等[5-6]。大多數(shù)葡萄籽被丟棄，利用率很低，造成了極大的資源浪費(fèi)[6]。葡萄籽中富含多酚類物質(zhì)，原花青素是葡萄籽中的主要多酚物質(zhì)[7]。原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化作用，其自由基清除能力比維生素C和維生素E高很多[8-9]。近年來，原花青素被報(bào)道具有緩解硝基苯酚PNP誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞氧化損傷等各種毒性作用[10]。因此，葡萄籽原花青素可能具有緩解硝基苯酚誘導(dǎo)免疫毒性的作用。研究葡萄籽原花青素對(duì)汽車尾氣活性成分誘導(dǎo)的免疫毒性影響，不僅為葡萄籽的有效科學(xué)利用提供理論依據(jù)，也對(duì)解決由空氣污染引起的健康問題的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級(jí)8w齡昆明雄性小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；PNMC(TCI，日本)；RPMI 1640培養(yǎng)基(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽原花青素提取 葡萄籽粉碎后經(jīng)石油醚脫脂并干燥，準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥脫脂葡萄籽粉置于100 mL三角瓶中，加入20 mL pH 4.0的緩沖液，調(diào)節(jié)纖維素酶液活力至100 U/mg，45 ℃酶解1.0 h后迅速升溫至90 ℃充分滅活，1 500 r/min離心分離并保存上清液，加入70%的乙醇溶液于50 ℃水浴30 min后進(jìn)行抽濾、70℃減壓蒸餾濃縮至沒有液滴滴出、濃縮物經(jīng)冷凍干燥得葡萄籽原花青素粗提物。在100 mL錐形瓶中加入5 g經(jīng)前處理好的AB-8大孔樹脂，再加入50 mL 3 mg/mL 原花青素粗提物水溶液，放入25 ℃搖床中振蕩吸附24 h(振蕩速度為160 r/min)，過濾除去未吸附的原花青素粗提物水溶液，蒸餾水沖洗過的樹脂倒入50 mL 50%的乙醇中25 ℃、160 r/min解吸24 h，濾出解析液、70 ℃減壓蒸餾濃縮至沒有液滴滴出，冷凍干燥得到葡萄籽原花青素提取物。

1.2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 小鼠脫頸處死，放入75%乙醇中殺菌3min。無菌狀態(tài)下取脾，置于200目篩網(wǎng)上，一邊滴加RPMI 1640完全培養(yǎng)基，一邊輕輕研磨，沖洗并收集篩網(wǎng)上脾研磨液。向脾研磨液中加入5.0mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基均質(zhì)，離心(1 500r/min、5min)得脾細(xì)胞沉淀，取適量NH4Cl(0.8%，w/v)裂解液裂解紅細(xì)胞3min。再次離心(1 500r/min、5min)分離得細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀2次，再用PRMI 1640完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀1次，離心(1 500r/min、5min)得細(xì)胞沉淀。加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行染色，活細(xì)胞計(jì)數(shù)將存活率控制在95%以上。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定 制備濃度為5×106cells/mL脾淋巴細(xì)胞懸液，向96孔板中加入脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液100μL/well，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔加入100μL樣品，對(duì)照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組為10-4mol/L PNMC、保護(hù)組為10-4mol/L PNMC。將加完樣的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入20μL/well的MTT溶液，繼續(xù)置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。小心吸棄150μL上清液，每孔加入150μL DMSO，搖床20min。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于570nm波長下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值(OD)并記錄。

1.2.4 細(xì)胞因子的測(cè)定 向96孔板中加入脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液100μL/well，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔加入100μL樣品，其中對(duì)照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組10-4mol/L PNMC、保護(hù)組為10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL 原花青素，再置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收集上清液待測(cè)。按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的方法測(cè)定上清液中各個(gè)細(xì)胞因子的含量。

1.2.5 OH·、MDA、SOD及GSH-Px水平的測(cè)定 脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液以100μL/well的添加量加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔加入100μL樣品，其中對(duì)照組為RPMI 1640完全培養(yǎng)基、染毒組為10-4mol/L PNMC、保護(hù)組為10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL PC，再置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h按照抗氧化實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。OH·水平通過酶標(biāo)儀550nm各孔吸光值(OD)確定、MDA水平通過酶標(biāo)儀532nm各孔吸光值(OD)確定、SOD水平通過酶標(biāo)儀450nm各孔吸光值(OD)確定、GSH-Px活性的測(cè)定包括酶促反應(yīng)和顯色反應(yīng)，最后酶標(biāo)儀412nm測(cè)定各管吸光度值(OD)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)均進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，方差分析使用SPSS軟件進(jìn)行a post hoc test及Tukey’s test，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異、P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖毒性

為研究葡萄籽原花青素對(duì)PNMC誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖毒性的影響，將脾淋巴細(xì)胞分為對(duì)照組(control)、染毒劑組(PNMC)和保護(hù)組(PNMC+PC)等3個(gè)組，培養(yǎng)48h后通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。對(duì)照組為用正常培養(yǎng)基處理的細(xì)胞，染毒劑組為用10-4mol/L PNMC處理的細(xì)胞，保護(hù)組為10-4mol/L PNMC和 1.0μg/mL原花青素(PC)處理的細(xì)胞。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)用PNMC處理的染毒劑組脾淋巴細(xì)胞活力明顯下降至87.60%(與對(duì)照組相比，P<0.05)，而當(dāng)PNMC與PC共同處理脾淋巴細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力為95.38%(與PNMC組相比，P<0.05；與對(duì)照組相比，無顯著性差異)，細(xì)胞活力下降得到顯著抑制，基本恢復(fù)到對(duì)照組的水平(圖1)。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素能夠顯著抑制PNMC對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的增殖毒性作用。

圖1 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚 對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖毒性 注：脾淋巴細(xì)胞與培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+ PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，PC代表原花青素；與對(duì)照相比，*P<0.05為顯著性差異；與PNMC相比，#P<0.05為顯著性差異

2.2 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚干擾脾T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能作用

脾臟是人體最大的免疫器官，可以調(diào)節(jié)造血功能和免疫系統(tǒng)，是機(jī)體抵御外界入侵的天然防線。脾臟中含有大量的淋巴細(xì)胞，其中脾T淋巴細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫功能，IL-2、IL-4和granzyme-B是由脾T淋巴細(xì)胞分泌的3種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。為研究葡萄籽原花青素是否具有緩解PNMC干擾脾T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能作用，通過ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞因子濃度來進(jìn)行評(píng)估。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PNMC處理小鼠脾淋巴細(xì)胞時(shí)，顯著地降低了小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平。對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4和granzyme-B分別為460、32.0、432.23 pg/mL，而PNMC處理過的染毒劑組的脾細(xì)胞分泌量分別降至163、23.78、223.73 pg/ mL。 當(dāng)用原花青素同時(shí)處理暴露于PNMC的脾淋巴細(xì)胞時(shí)，其分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4和granzyme-B的水平，又上調(diào)至364、29.61、400.96 pg/mL(圖2C)，即細(xì)胞因子分泌量下降得到抑制。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素具有顯著抑制PNMC干擾脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能作用。

圖2 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對(duì)脾T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能損傷 注：小鼠脾淋巴細(xì)胞和培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，細(xì)胞分泌IL-2(A)、IL-4(B)、granzyme-B(C)的水平；與對(duì)照相比,*P<0.05為顯著性差異、**P<0.01為極顯著性差異；與PNMC相比，#P<0.05為顯著性差異

2.3 葡萄籽原花青素緩解硝基苯酚對(duì)脾淋巴細(xì)胞的氧化毒性

為了檢測(cè)葡萄籽原花青素是否可以抑制由PNMC在脾淋巴細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激作用，本研究通過檢測(cè)OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平來評(píng)估其抗氧化活性?？寡趸囼?yàn)結(jié)果顯示，脾淋巴細(xì)胞暴露于PNMC后，OH·和MDA含量得到顯著上升，OH·含量從660.9U/mL增加至853.3U/mL(圖3A)、MDA水平從0.53mmol/mL上升至0.60 mmol/mL(P<0.05)(圖3D)。相反地，和對(duì)照組相比，PNMC降低了脾淋巴細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性，均具有顯著性。SOD活性分別降低至對(duì)照的84.3%(P<0.05)(圖3B)，GSH-Px的活性降低至對(duì)照的70.7%(P<0.05)(圖3C)。然而，當(dāng)葡萄籽原花青素聯(lián)合PNMC共培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞后，OH·和MDA含量上升和SOD和GSH-Px活性降低得到顯著抑制。 OH·含量僅為819.9U/mL(單獨(dú)接觸PNMC組為853.3U/mL，下降具有顯著性，P<0.05，圖3A)，MDA水平由單獨(dú)接觸PNMC組的0.6 mmol/mL下調(diào)至0.5 mmol/mL(下降具有顯著性，P<0.05，圖3D)。相反地，與單獨(dú)的PNMC處理組相比，顯示聯(lián)合原花青素共培養(yǎng)后脾淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶 SOD活性84.3%恢復(fù)至89.9%(P<0.01，圖3B)、GSH-Px活性從70.7%恢復(fù)至104.6%(P<0.05，圖3C)。以上結(jié)果表明，葡萄籽原花青素顯著緩解硝基苯酚對(duì)脾淋巴細(xì)胞的氧化毒性作用。

圖3 葡萄籽原花青素對(duì)暴露于PNMC的脾淋巴細(xì)胞內(nèi)OH·、SOD、GSH-Px 和MDA水平的影響 注：小鼠脾淋巴細(xì)胞和培養(yǎng)基(control)、PNMC(10-4mol/L)、PNMC(10-4mol/L)+PC(1.0μg/mL)共培養(yǎng)48h，細(xì)胞內(nèi)OH·(A)、SOD(B)、GSH-Px(C)、MDA(D)的水平；與對(duì)照相比,*P<0.05為顯著性差異；與PNMC相比,#P <0.05為顯著性差異

3 結(jié)論

本文研究葡萄籽原花青素對(duì)汽車尾氣有效活性成分PNMC誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫毒性影響的結(jié)果表明，葡萄籽原花青素不僅顯著緩解PNMC對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的增殖毒性，還可以緩解PNMC對(duì)脾T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能的損傷，起到保護(hù)脾淋巴細(xì)胞的作用。葡萄籽原花青素對(duì)PNMC誘導(dǎo)的免疫毒性的抑制作用與其抗氧化性具有密切的關(guān)系?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Grape Seed Proanthocyanidin Attenuates Immunotoxicity Induced by Nitrophenol

WAN Yi-fang，YE Si-yan，DUAN Shu-qi，DU Sheng-jie，RUAN Xin-wei，XU Mei-yu

(College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing 100083，China)

3-methyl-4-nitrophenol (PNMC)，as a kind of important component of vehicle emissions，has been shown to confer toxicity in splenocytes.Proanthocyanidin，as a dietary polyphenols, has been shown to confer inhibitory activity against a variety of toxins，and grape seed is rich in proanthocyanidins.The effects of grape seed proanthocyanidin on immunotoxicity induced by PNMC in murine splenic lymphocytes were investigated by Cell Viability Assay and ELISA，and the results showed that grape seed proanthocyanidin significantly enhanced proliferation of splenocytes exposed to PNMC，as well as the production of T cell-related cytokines and granzymes includinginterleukin-2，interleukin-4，andgranzyme-Bin the cells exposed to PNMC.These effects were associated with a decrease in oxidative stress，as evidenced by changes in OH·，SOD，GSH-Px，and MDA levels.

grape seed proanthocyanidin；3-methyl-4-nitropheno(PNMC)；attenuates immunotoxicity；splenic lymphocyte

北京林業(yè)大學(xué)“北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃”(項(xiàng)目編號(hào)：S201510022036)；北京市自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：8142029)。

萬一方(1996— )，女，本科生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

許美玉(1965— )，女，副教授，研究方向：食品免疫與功能性食品。