嚴(yán)小莉高靜賢劉茜王莎莎楊宇民

液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性檢測方法探討

嚴(yán)小莉1高靜賢1劉茜1王莎莎1楊宇民2

目的 應(yīng)用浸提液試驗（MTT比色法）和直接接觸試驗兩種方法對液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性進行檢測。方法 考慮到液體創(chuàng)口貼的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故將液體創(chuàng)口貼室溫下成膜于培養(yǎng)皿上再加入細(xì)胞培養(yǎng)液進行浸提。結(jié)果 這兩種試驗方法在低濃度（0．125 g/皿、0．2 5 g/皿和0．5 g/皿）時結(jié)果基本一致，而高濃度（1 g/皿和2 g/皿）時差異較大。結(jié)論 在實際檢測時，需明確檢驗方法及樣品濃度。

液體創(chuàng)口貼；細(xì)胞毒性；直接接觸法；MTT比色法

液體創(chuàng)可貼是近年來新出現(xiàn)的有別于傳統(tǒng)繃帶創(chuàng)可貼的新型創(chuàng)可貼。由于液體創(chuàng)口貼是直接與傷口創(chuàng)面接觸的，故需對其進行生物學(xué)評價[1]。而體外細(xì)胞毒性實驗具有操作簡單、易標(biāo)準(zhǔn)化、周期短、敏感性強且能定量分析等優(yōu)點，是醫(yī)療器械生物安全性評價體系中最重要的檢測指標(biāo)之一[2]?，F(xiàn)選擇了兩類細(xì)胞毒性試驗方法：浸提液試驗（MTT比色法）和直接接觸試驗，依據(jù)GB/T16886.5-2003和ISO 10993.5-2009標(biāo)準(zhǔn)中的方法進行了試驗[3-5]。浸提液試驗是目前檢測中最常用的細(xì)胞毒性檢測方法，但是在GB/T 16886.12-2005和ISO 10993.12-2012中只規(guī)定了固體類材料的樣品浸提制備方法，對于液體類的沒有明確的規(guī)定[6-7]。而浸提液的制備對于檢測結(jié)果的影響是非常大的，試驗中考慮到液體創(chuàng)口貼的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故讓液體創(chuàng)口貼室溫下成膜后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液進行浸提。通過兩種試驗方法的比較對液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性檢測方法進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗細(xì)胞選取L929小鼠成纖維細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。主要藥品與試劑：RPMI1640培養(yǎng)液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。液體創(chuàng)口貼隨機取樣于同一廠家送檢的同批次產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 直接接觸法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創(chuàng)口貼置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其均勻鋪于培養(yǎng)皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml濃度為1×104U/ml的細(xì)胞懸液，取空白培養(yǎng)皿作為陰性對照，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h、48 h和72 h取出培養(yǎng)皿，置倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創(chuàng)口貼置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其均勻鋪于培養(yǎng)皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。置于37℃放置24 h制備浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作為陰性對照品；5%的DMSO溶液作為陽性對照。將培養(yǎng)至近匯合的L-929細(xì)胞消化，稀釋為1×104U/ml的細(xì)胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除每孔中原培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M加新鮮培養(yǎng)液200 μl，各組分別加樣品浸提液、陰性與陽性對照樣品浸提液200 μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)板取出，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移除孔內(nèi)液體，加入200 μl DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，選擇570 nm在ELX800UV型酶標(biāo)儀上測定光密度（optical density，OD）值，按公式計算相對增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用計算機統(tǒng)計軟件包Statistica對數(shù)據(jù)作Students’t檢驗，數(shù)據(jù)采用（Mean±SEM）表示，確定差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 直接接觸法

共培養(yǎng)24 h后，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞能貼壁于膜上生長，細(xì)胞形態(tài)呈長條梭形或不規(guī)則多邊形，1 g/皿和2 g/皿的細(xì)胞變圓或裂解死亡，未能貼附生長。隨著培養(yǎng)時間的增加，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞大量增殖，共培養(yǎng)72 h后，0.125 g/皿和0.25 g/皿兩組視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量差別不大，0.5 g/皿組的細(xì)胞數(shù)量較之前兩組較少，1 g/皿和2 g/皿的細(xì)胞已死亡殆盡，見圖1。

2.2 MTT（四唑鹽）比色法

表1為各浸提比例浸提液的細(xì)胞相對增殖率。結(jié)果顯示：隨著浸提比例的增加，細(xì)胞的相對增殖率越來越低。

3 討論

液體創(chuàng)可貼屬于生物成膜型生物制品，將其噴涂或涂抹在創(chuàng)面能快速干燥并形成透氣、防水、柔軟且有彈性的保護膜。它具有隔菌、透氣、防水、使用方便、易于觀察傷口情況及促進傷口恢復(fù)等特點[8]。不含藥物的液體創(chuàng)可貼屬于醫(yī)療器械范疇，按照國家醫(yī)療器械的分類規(guī)則，其屬于Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品[9]。國家對Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品是進行注冊管理的。在現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，還沒有針對液體創(chuàng)口貼的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前其在注冊申請時都是依據(jù)企業(yè)提供的產(chǎn)品技術(shù)要求或是委托書進行檢測，沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。隨著此類產(chǎn)品申請注冊企業(yè)的增多，為保證其使用的安全性，建立合適的檢驗方法體系進行生物學(xué)評價是必要的步驟。而體外細(xì)胞毒性試驗是生物學(xué)評價中不可或缺的一項試驗，是評價醫(yī)療器械產(chǎn)品毒性反應(yīng)的一項重要指標(biāo)。

試驗中選擇了直接接觸法和浸提液法對液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性進行了檢測。在進行浸提液制備時，如果將液體創(chuàng)口貼直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液制備浸提液，會形成絮狀物，無法進行試驗?？紤]到它的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故在進行試驗時都是將其先晾干成膜，再進行檢測。

GB/T16886.5-2003標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了直接接觸法的試驗步驟：是將細(xì)胞培養(yǎng)到近匯合的狀態(tài)，再將樣品置于細(xì)胞上方，共培養(yǎng)后觀察樣品下方以及周圍細(xì)胞生長狀態(tài)，進行分類分級。本試驗中由于樣品成膜后較輕，如果將膜置于細(xì)胞上方會漂浮在培養(yǎng)液中，無法固定，從而無法進行后期觀察。故在進行本試驗時，是將液體創(chuàng)口貼直接成膜貼附于培養(yǎng)皿中，再將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。結(jié)果顯示：0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞能貼壁于膜上生長，且隨著共培養(yǎng)時間的增加，視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量也增加，這與MTT比色法的結(jié)果一致。1 g/皿和2 g/皿組在直接接觸法中細(xì)胞在24 h未能貼附生長就已死亡殆盡，但在MTT比色法中這兩組細(xì)胞增殖率分別為54.6%、40.4%。這兩組結(jié)果直接接觸法的細(xì)胞毒性高于MTT比色法，分析原因可能是MTT比色法中細(xì)胞是貼附生長后再加的浸提液，因而浸提液中的毒性物質(zhì)對細(xì)胞的增殖影響較大，對細(xì)胞的貼壁影響不大；直接接觸法是細(xì)胞懸液直接加入到膜上，樣品釋放的毒性物質(zhì)使得細(xì)胞不能貼壁，也就不能增殖生長。

表1 各浸提比例浸提液的細(xì)胞相對增殖率

圖1 L-929細(xì)胞與各比例的液體創(chuàng)口貼膜共培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后的細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×400）

綜合這兩種方法的檢測結(jié)果，這兩種細(xì)胞毒性檢測方法都能適用于液體創(chuàng)口貼的檢測。但由于這兩種檢測方法的原理不同，對檢測結(jié)果也有很大的影響。而且樣品濃度的選擇也會直接影響檢測的結(jié)果。此外，國內(nèi)液體創(chuàng)可貼尚未有國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì)量控制，都是企業(yè)內(nèi)部技術(shù)要求，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，需要制定相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行管理控制?，F(xiàn)行的國際、國家標(biāo)準(zhǔn)只是對醫(yī)療器械生物學(xué)評價給出了籠統(tǒng)的指導(dǎo)原則，并沒有實際的針對性[10]。因此在實際的醫(yī)療器械檢測過程中，需要我們檢測人員根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性，探尋出合理有效地檢測方法，以期達到有效地評價醫(yī)療器械產(chǎn)品細(xì)胞毒性的目的。

[1] GB/T16886．1-2011． 醫(yī)療器械生物學(xué)評價第1部分風(fēng)險管理過程中的評價與試驗[S]． 2011．

[2] 高靜賢，王莎莎，金夢，等． 醫(yī)用超聲耦合劑體外細(xì)胞毒性檢測的探討[J]． 中國醫(yī)療器械雜志，2013，37（3）：210-212．

[3] GB/T16886．5-2003． 醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分體外細(xì)胞毒性試驗[S]． 2003．

[4] ISO 10993-5：2009． Biological evaluation of medical devices-Part 5：Test for in vitro cytotoxicity[S]． 2009．

[5] 奚廷斐． 醫(yī)療器械生物學(xué)評價[M]． 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012：96-107．

[6] GB/T 16886．12-2005． 醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分:樣品制備與參照樣品[S]． 2005．

[7] ISO 10993-12：2012． Biological evaluation of medical devices -Part 12：Sample preparation and reference materials[S]． 2012．

[8] 劉海霞，張愛軍，張林． 液體創(chuàng)可貼的研究進展[J]． 中國醫(yī)藥科學(xué)，2016，6（4）：28-31．

[9] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局． 醫(yī)療器械分類規(guī)則（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第15號）[S]． 2015．

[10] 孫皎． 醫(yī)療器械的生物學(xué)評價與風(fēng)險探討[J]． 中國醫(yī)療器械雜志，2006，30（5）：386-387，382．

Discuss the Vitro Cytotoxicity Test of Liquid Bandage

YAN Xiaoli1GAO Jingxian1LIU Qian1WANG Shasha1YANG Yumin21 Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing Jiangsu 210022, China; 2 Key Laboratory for Nerve Regeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu 226000, China

Objective The cytotoxicity of liquid bandage was tested by MTT assay and direct contact. Methods Considering the using condition of liquid bandage, the sample was prepared to make extraction on the film formation. Results The results of the two tests were consistent at 0.125 g/plate, 0.25 g/plate and 0.5 g/plate. At 1 g/plate and 2 g/plate, significant different appeared in the tests. Conclusion The experimental condition and the preparative method of extraction should be determined.

liquid bandage; cytotoxicity; direct contact test; MTT assay

R446

A

1674-9316（2017）04-0112-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．04．071

國家自然科學(xué)基金課題（81371687）

1 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所，江蘇 南京 210022；2 南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇 南通 226000