王超+顧冬冬+王彥+韓雪春

[摘要] 應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，建立七葉膽苷ⅩⅤⅡ體內(nèi)分析方法，方法學(xué)結(jié)果顯示線性范圍為1～2 500 μg·L-1（r=0.996 3）；高、中、低3種不同濃度的日內(nèi)RSD分別為9.9%，3.0%，1.7%；日間RSD分別為16%，14%，2.5%；基質(zhì)效應(yīng)90.0%～100%，RSD<15%；回收率>80.0%。對大鼠靜脈和灌胃給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ?qū)φ掌泛鬁y定血漿中濃度隨時間的動態(tài)變化過程，繪制藥時曲線，并根據(jù)藥時曲線計算藥代動力學(xué)參數(shù)。用DAS 2.0軟件計算得到七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內(nèi)口服藥代動力學(xué)參數(shù)tmax為0.17～0.20 h，t1/2為1.94～2.56 h，生物利用度為1.87%。結(jié)果顯示七葉膽苷ⅩⅤⅡ藥動學(xué)特征為口服吸收分布快，達峰時間快，消除快。

[關(guān)鍵詞] 七葉膽苷ⅩⅤⅡ； 藥代動力學(xué)； LC-MS/MS； 血藥濃度

[Abstract] In this study， we established an HPLC-MS method to determine gypenoside ⅩⅤⅡ in biosamples. The methodology results indicated that the linear range was 1-2 500 μg·L-1（r=0.996 3）； intraday RSD values for high， medium and low concentrations were 9.9%， 3.0% 1.7%； interday RSD values were 16%， 14%， 2.5%； matrix effect ranged between 90.0%-100%， with RSD<15%. The recovery was more than 80.0%， with precision and accuracy in line with request. After the rats were orally and intravenously administered with gypenoside ⅩⅤⅡ， the concentrations of gypenoside ⅩⅤⅡ in plasma were determined， and pharmacokinetic parameter was calculated using pharmacokinetic software DAS 2.0. According to the main pharmacokinetic parameters of gypenoside ⅩⅤⅡ， tmax was 0.17-0.20 h， t1/2 was 1.94-2.56 h， bioavailability of oral administration was 1.87%. The results indicated that the pharmacokinetic profiles of gypenoside ⅩⅤⅡ were rapid absorption and distribution after oral administration， short time to peak and rapid elimination.

[Key words] pypenoside ⅩⅤⅡ； pharmacokinetics； LC-MS/MS； plasma concentration

三七Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen為五加科人參屬植物，又名田七、金不換等，為我國名貴中藥材，產(chǎn)于云南和廣西[1]。三七具有活血化瘀、消腫止痛和滋補強壯等功效[2]，主要化學(xué)成分為皂苷、黃酮、多炔醇、多糖、氨基酸、肽以及脂肪酸等，其中三萜皂苷類成分是三七制劑的主要有效成分和質(zhì)控指標(biāo)[3]。目前對于皂苷的研究大多數(shù)集中于三七藥材中含量較高的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd等[4-5]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七中含有的一些微量皂苷成分也具有很顯著的藥理活性。七葉膽苷在體內(nèi)具有抗腫瘤活性，其可能機制為代謝生成了具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的20-O-（β-吡喃葡萄糖基）-20（S）-原人參二醇[6]。據(jù)報道，從三七中發(fā)現(xiàn)的一種新的植物雌激素七葉膽苷ⅩⅤⅡ?qū)儆谄呷~膽苷類化合物，通過抑制氧化應(yīng)激，抑制腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，進而抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與抑制免疫炎癥因子的分泌和自由基清除作用有關(guān)，從而起到防止動脈粥樣硬化的作用[7]。為了更好地理解七葉膽苷ⅩⅤⅡ的作用機理、作用過程，有必要全面了解其體內(nèi)動態(tài)變化規(guī)律。本研究監(jiān)測七葉膽苷ⅩⅤⅡ大鼠體內(nèi)血藥濃度變化規(guī)律，為后期藥物安全性評價、臨床新藥研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀，Thermo TSQ Vantage，ESI 離子源，XS105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Legend Micro17 微量臺式離心機（美國Thermo Finnigan 公司）；Vortex Genie-2 渦旋振蕩器（美國Scientific 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波清洗器）。

七葉膽苷ⅩⅤⅡ?qū)φ掌罚ㄅ?30421，純度>98%）和內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1（批號140809，純度>95%）購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；甲酸（分析純，中國國藥控股有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）。

雄性/雌性Wistar大鼠，體重（200±20） g，購自北京維通利華有限公司。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫 45 ℃；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，10%～50%B，2～3.5 min，50%～90%B，3.5～6 min，90%B，6～6.5 min，90%～10%B，流速0.4 mL·min-1；進樣體積10 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：Thermo TSQ Vantage三重四級串聯(lián)質(zhì)譜儀；ESI離子源；負(fù)離子檢測模式；離子源參數(shù)設(shè)置：噴霧電壓（spray voltage）3.0 kV；噴霧溫度（vaporizer temperature）200 ℃；鞘氣流速（sheath gas）40 unit；輔助氣流速（aux gas）10 unit；毛細(xì)管溫度（capillary temperature） 300 ℃；碰撞氣（collision gas， argon）1.5 mTorr；質(zhì)譜掃描模式選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）：七葉膽苷ⅩⅤⅡ m/z 945.5/783.8，CE 31 eV；GRg1 m/z 799.5/637.6，CE 24 eV。所有操作以及數(shù)據(jù)處理由Xcalibur（version 2.2）軟件控制。

2.2 給藥方案與血樣采集

2.2.1 尾靜脈給藥

12只SD大鼠，實驗前禁食12 h，實驗期間自由飲水。以2 mg·kg-1經(jīng)尾靜脈注射給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ溶液，于給藥后5，10，20，40，60，120，180，240，360，480，720 min經(jīng)眼球后靜脈叢采血 0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1離心 10 min，吸取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.2.2 口服給藥

12只SD大鼠，實驗前禁食12 h，實驗期間自由飲水。以50 mg·kg-1（2.0 mL·kg-1）的劑量口服給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ溶液，于給藥后5，10，20，40，60，90，120，180，240，360，480，720 min經(jīng)眼球后靜脈叢采血0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1離心 10 min，吸取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取大鼠血漿樣品50 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，甲醇150 μL，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，吸取上清液10 μL，進樣分析，記錄色譜圖。此外，由于靜注給藥后5 min血藥濃度超過了儀器的定量上限。因此，將該時間點得到的血漿樣品用空白血漿稀釋1倍后再按照上述處理方法處理。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

取大鼠空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液并補加相應(yīng)體積的甲醇外，其余按2.3項下操作，獲得空白血漿樣品色譜圖；另取50 μL質(zhì)量濃度為500 μg·L-1的七葉膽苷ⅩⅤⅡ?qū)φ杖芤海?7 ℃氮氣吹干后，加入50 μL空白血漿渦旋混合均勻，其余按2.3項下操作，獲得模擬生物樣品色譜圖；再取靜注給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ（2.0 mL·kg-1）后60 min血漿樣品，按2.3項下操作，獲得給藥血漿樣品色譜圖。

2.4.2 線性關(guān)系、檢測限與定量限試驗

精密移取各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后，加入50 μL空白血漿渦旋混合均勻配制成相當(dāng)于1，5，10，50，100，500，1 000，2 500 μg·L-1的七葉膽苷ⅩⅤⅡ標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其余按2.3項下操作。以七葉膽苷ⅩⅤⅡ濃度為橫坐標(biāo)（C），七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（R），以加權(quán)（1/x2）最小二乘法進行線性回歸運算，得回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗

按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含七葉膽苷ⅩⅤⅡ質(zhì)量濃度分別為5，50，2 000 μg·L-1的質(zhì)量控制 （QC）樣品，每個濃度平行配制5份。取空白血漿50 μL，按2.3項下操作，連續(xù)測定3 d，記錄色譜圖，計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值fx，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實測濃度及實測濃度準(zhǔn)確度，計算日內(nèi)和日間精密度，與配制濃度相比，求得方法的準(zhǔn)確度。

2.4.4 提取回收率試驗

精密移取各QC標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL，渦旋混合均勻后加入200 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，分取上層清液150 μL，加入內(nèi)標(biāo)50 μL，渦旋混合均勻后，吸取10 μL進樣分析，記錄色譜圖，每一濃度平行配制5份，計算各濃度樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值A(chǔ)。

另取空白血漿50 μL，加入甲醇200 μL沉淀蛋白，渦旋混合30 s，15 000×g離心10 min，分取上層清液，得空白血漿上清液。另取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，置1.5 mL離心管中，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿上層清液250 μL，渦旋混合均勻后，吸取150 μL加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合均勻后吸取10 μL進樣分析，記錄色譜圖，每一濃度平行配制5份，計算各濃度樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值B。A與B的比值即為七葉膽苷ⅩⅤⅡ的提取回收率。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

2.4.5.1 短期穩(wěn)定性 精密移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當(dāng)于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，在室溫下放置24 h后按2.3項下操作，每一濃度5個樣品，記錄相應(yīng)的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值帶入隨行標(biāo)曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算實測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品短期穩(wěn)定性。若比值為85.0%～115%，則認(rèn)為樣本穩(wěn)定。

2.4.5.2 長期穩(wěn)定性 精密移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當(dāng)于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，在-20 ℃冰箱中放置14 d后按2.3項下操作，每一濃度5個樣品，記錄相應(yīng)的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值帶入隨行標(biāo)曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品的長期穩(wěn)定性。若比值在85.0%～115%，則認(rèn)為樣本穩(wěn)定。

2.4.5.3 凍融穩(wěn)定性 精密移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當(dāng)于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，置-20 ℃冰箱儲存24 h，取出解凍后再置于-20 ℃儲存24 h，取出，解凍，再置-20 ℃儲存24 h取出解凍后進樣分析，記錄相應(yīng)的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值帶入隨行標(biāo)曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品的凍融穩(wěn)定性。若比值在85.0%～115%，則可認(rèn)為樣本穩(wěn)定。

2.4.5.4 樣品在進樣器中穩(wěn)定性 精密移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，37 ℃氮氣吹干后加入空白血漿50 μL。配制成相當(dāng)于七葉膽苷ⅩⅤⅡ質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的QC樣品，按2.3項下操作，在自動進樣器中放置8 h后進樣分析，每一濃度5個樣品，記錄相應(yīng)的色譜圖。將七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值帶入隨行標(biāo)曲中計算七葉膽苷ⅩⅤⅡ的實測濃度，計算所測濃度與制備濃度的比值從而求得樣品在進樣器中的穩(wěn)定性。若比值在85.0%～115%，則可認(rèn)為樣本穩(wěn)定。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿，按2.3項下操作制備空白血漿上清液適量，備用。精密移取100 μL質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL離心管中，以氮氣流吹干。殘渣以空白血漿上清液100 μL復(fù)溶，15 000×g離心10 min，分取上層清液，進行LC-MS分析。記錄色譜圖，記錄七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積A。

精密移取100 μL質(zhì)量濃度為5，50，2 000 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL離心管中，以氮氣流吹干。殘渣以蒸餾水100 μL復(fù)溶，15 000×g離心10 min，分取上層清液，進行LC-MS分析。記錄色譜圖和七葉膽苷ⅩⅤⅡ峰面積B，計算基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）。ME=A/B×100%。若ME在85.0%～115%，則可認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 藥動學(xué)研究

實驗資料采用中國藥理學(xué)會編寫的藥代動力學(xué)統(tǒng)計軟件包DAS 2.0進行非房室模型擬合，計算口服給藥的生物利用度（bioavailability，BA）。BA=（AUCpo × Dose iv）/（AUCiv × Dosepo）×100%。

3 結(jié)果

3.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

對七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內(nèi)標(biāo)Rg1進行質(zhì)譜全掃模式研究。在負(fù)離子模式下，七葉膽苷ⅩⅤⅡ能夠產(chǎn)生m/z 915.98[M-H]-，對其進行二級質(zhì)譜分析，其主要碎片為m/z 783.87。因此，選擇離子對m/z 945.5/783.94為七葉膽苷ⅩⅤⅡ的SRM定量離子對。同樣對內(nèi)標(biāo)GRg1也進行相關(guān)二級能量等參數(shù)優(yōu)化，m/z 799.90/637.64作為GRg1的SRM定量離子對。在色譜條件優(yōu)化過程中，選擇不同流動相進行相關(guān)實驗，乙腈作為有機相時峰型較好，分析時間較短，最終選擇乙腈作為有機相。

3.2 血漿樣品處理方法

比較了有機溶劑沉淀蛋白、液-液萃取法和固相萃取法，固相萃取處理的樣品能除掉大部分的鹽和干擾物質(zhì)，但萃取小柱價格昂貴，沉淀蛋白處理的樣品操作簡單，重復(fù)性好，成本最低。因此從經(jīng)濟角度考慮選擇沉淀蛋白作為樣本處理方法。

3.3 分析方法學(xué)驗證

3.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

空白血漿、空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品以及給藥后所得血漿色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內(nèi)標(biāo)保留時間分別為3.67，2.51 min，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾七葉膽苷ⅩⅤⅡ和內(nèi)標(biāo)的測定。

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限

以七葉膽苷ⅩⅤⅡ濃度為橫坐標(biāo)，七葉膽苷ⅩⅤⅡ與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法進行線性回歸運算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為R=0.007 07+0.006 11 C，r=0.996 3， weight=1/c/c。標(biāo)準(zhǔn)曲線各個濃度點的準(zhǔn)確度在85.0%～115%。結(jié)果表明，七葉膽苷ⅩⅤⅡ在1～2 500 μg·L-1線性關(guān)系良好。方法檢測限（LOD）為0.3 μg·L-1（S/N>3），最低定量限（LLOQ）為1 μg·L-1（S/N>10），表明該方法靈敏度較高，可用于七葉膽苷ⅩⅤⅡ的微量分析。

3.3.3 精密度與準(zhǔn)確度

精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表1，結(jié)果表明，高、中、低3個濃度日內(nèi)精密度與日間精密度RSD均小于15%，準(zhǔn)確度為93.90%～99.41%。

3.3.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率（絕對回收率）

方法提取回收率結(jié)果見表2，結(jié)果表明，高、中、低3個濃度提取回收率均符合生物樣本的分析要求，且RSD均小于15%，該方法提取回收率較高?；|(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果表明，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾七葉膽苷ⅩⅤⅡ的測定，ME為90.0%～100%，且RSD小于15%。

3.3.5 樣本穩(wěn)定性

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，七葉膽苷ⅩⅤⅡ在血漿中-20 ℃放置14 d，室溫下放置24 h，經(jīng)過3個凍融

結(jié)果表明，所建立的血漿樣品分析方法符合有關(guān)規(guī)定的要求，可以用于七葉膽苷ⅩⅤⅡ體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

3.4 藥動學(xué)研究

3.4.1 靜脈注射給藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程

大鼠靜脈注射給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ（2 mg·kg-1）后，其體內(nèi)血藥濃度-時間曲線見圖2。七葉膽苷ⅩⅤⅡ靜脈注射后能夠快速從大鼠體內(nèi)消除，給藥后12 h其體內(nèi)血藥濃度基本檢測不到（低于LLOQ）。七葉膽苷ⅩⅤⅡ的總體清除率CL為（3.45±1.70） L·kg-1·h-1，其消除半衰期t1/2小于2 h，藥動學(xué)非房室分析所得藥動學(xué)參數(shù)見表4。

3.4.2 口服給藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程

大鼠口服給予七葉膽苷ⅩⅤⅡ后（50 mg·kg-1），其體內(nèi)血藥濃度-時間曲線見圖3。

七葉膽苷ⅩⅤⅡ口服給藥后能夠迅速從胃腸道吸收進入血中，給藥后5 min在血中可以檢測到七葉膽苷ⅩⅤⅡ，并迅速達到最大血藥濃度，達峰時間為0.19 h。口服給藥后七葉膽苷ⅩⅤⅡ消除非?？?，半衰期較短?？诜锢枚容^低，為1.87%，可能是由于其極性大，脂溶性較差，難以透過腸系膜所致。非房室模型分析所得藥動學(xué)參數(shù)見表5。七葉膽苷ⅩⅤⅡ無論靜注還是口服，其體內(nèi)滯留時間均較短，消除較快，半衰期約為2 h，屬于短半衰期類藥物。同時，體內(nèi)藥動學(xué)行為基本不存在性別差異；t1/2，MRT，CL等主要藥動學(xué)參數(shù)無顯著性差異。有文獻報道[8-9]，原人參二醇型皂苷三七皂苷Fc，人參皂苷Rb1等都屬于長半衰期（t1/2>20 h）的化合物，這表明皂苷類化合物半衰期可能與皂苷結(jié)構(gòu)中糖的種類、取代的位點以及糖的數(shù)目都有一定關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究建立了測定大鼠血漿中七葉膽苷ⅩⅤⅡ的LC-MS/MS方法，該方法簡單、靈敏、快捷，精密度等線性關(guān)系良好，可以用于生物樣本中七葉膽苷ⅩⅤⅡ的藥代動力學(xué)研究。這為理解七葉膽苷ⅩⅤⅡ的作用機制、作用過程奠定了基礎(chǔ)，為后期藥物安全性評價、臨床新藥研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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