沈淑潔+水素芳+肖炳坤+楊建云+黃榮清

[摘要] 為進(jìn)一步了解金鈴子散毒性影響的代謝特征，探索金鈴子散在治療過程中對(duì)未知生物通路的作用。該實(shí)驗(yàn)通過以金鈴子散3組劑量的水煎劑對(duì)大鼠肝腎的影響，來研究金鈴子散對(duì)大鼠體內(nèi)代謝組改變的特點(diǎn)和規(guī)律。首先對(duì)給藥2周和給藥后1周大鼠尿液和血清樣本采用質(zhì)譜分析方法，通過XCMS在線分析大鼠正負(fù)模式離子檢測譜，對(duì)代謝譜分析的代謝物進(jìn)行鑒定，結(jié)果得到44個(gè)差異性物質(zhì)。最后以MetPA對(duì)液質(zhì)實(shí)驗(yàn)中篩選出的代謝物組進(jìn)行代謝通路富集和分析，結(jié)果得到：類固醇激素合成代謝途徑，戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換，賴氨酸代謝，谷胱甘肽代謝和抗壞血酸代謝5條相關(guān)的代謝通路。 由代謝網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，與毒性相關(guān)的通路主要和生物體賴氨酸代謝、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化及激素代謝有關(guān)，尤其是賴氨酸和谷胱甘肽的代謝失衡，造成機(jī)體能量代謝或氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的紊亂，產(chǎn)生大鼠體內(nèi)的損傷。從金鈴子散低、中、高3組劑量的亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，金鈴子散19.7 g·kg-1和 39.4 g·kg-1劑量組造成了明顯的毒性作用，說明金鈴子散在生物體內(nèi)可產(chǎn)生毒性作用，且毒性隨著給藥劑量的增加而增加，造成不可逆的機(jī)體損傷。

[關(guān)鍵詞] 金鈴子散； 毒性； 代謝組學(xué)； 液質(zhì)聯(lián)用

[Abstract] To further understand the metabolic characteristics of Jinlingzi powder toxicity effect in rats and explore the effect of Jinlingzi powder on unknown biological pathways in the treatment process. In this experiment， the effect of three doses of Jinlingzi powder decoction on rat liver and kidney was investigated to explore the characteristics and rules of Jinlingzi powder on in vivo metabonomic changes in rats. First， urine and serum samples of the rats were used for LC-MS analysis. Under the XCMS online analysis， 44 differential substances were found in the identification of metabolites. Finally， Metpa was used for metabolic pathways enrichment and analysis， and five related metabolic pathways were obtained： steroid hormone biosynthesis， tryptophan metabolism， pentose and glucuronate interconversions， ascorbate and aldarate metabolism， as well as glutathione metabolism. Metabolic network diagram showed that the toxicity-related pathways were mainly associated with lysine metabolism in living organisms， glucuronic acid conversion， and hormone metabolism， especially the metabolism imbalance of lysine and glutathione would result in the disorder of energy metabolism or oxidative stress regulation， and thus inducing the damage in rats. Subacute toxicity test results for three doses groups （low， middle and high doses） showed that， Jinlingzi powder with doses of 19.7 g·kg-1 and 39.4 g·kg-1 caused obvious toxic effect， indicating Jinlingzi powder could produce toxic effect in vivo in a dose-dependent manner， and cause irreversible damage to the body.

[Key words] Jinlingzi powder； toxicity； metabonomics； LC-MS

代謝組學(xué)主要研究機(jī)體小分子代謝物與疾病的關(guān)系以及揭示機(jī)體內(nèi)生物化學(xué)變化的規(guī)律。將這樣的方法應(yīng)用在中藥毒性的研究中可以較容易的發(fā)現(xiàn)毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，對(duì)追蹤毒性作用的相關(guān)代謝途徑，尋找代表性的生物標(biāo)志物有重要作用[1-2]。

疏肝泄熱名方金鈴子散由川楝子和延胡索組成，而兩藥均有一定的肝腎毒性，尤其是川楝子早在《名醫(yī)別錄》就有記載“楝實(shí)有小毒。根微寒。治蛔蟲， 利大腸。生荊山” [3]。 但作為中藥復(fù)方金鈴子散毒性的探索并沒有報(bào)道，為進(jìn)一步明確金鈴子散對(duì)機(jī)體肝腎代謝機(jī)制的影響和產(chǎn)生的毒性作用，本實(shí)驗(yàn)從代謝組學(xué)的視角對(duì)金鈴子散作用于肝腎毒性的影響以及毒性標(biāo)志物的確定進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200/6410三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；HP ODS C18色譜柱（4.6 mm×100 mm， 5 μm）；大鼠不銹鋼代謝籠（北京龍東?？蒲性O(shè)備制造有限公司）；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）。

0.9%生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；甲酸（50%水溶液，色譜純，美國 Sigma-Aldrich 化工有限公司）；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司）；疊氮化鈉（NaN3，英國Alfa Aesar化工有限公司）；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；純化水（屈臣氏集團(tuán)有限公司）；延胡索（北京同仁堂有限責(zé)任公司，批號(hào)404002248P）；川楝子（北京同仁堂有限責(zé)任公司，批號(hào)101152286W）。

1.2 金鈴子散水煎液的提取 川楝子和延胡索各1 000 g，加10倍量水浸泡6 h，煎煮1 h，用醫(yī)用紗布過濾，混合第2次和第3次煎煮液，回流1 h，合并3次濾液，減壓濃縮至浸膏狀，濃縮至750 mL，然后在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥處理，濃縮液和藥材之比為1∶2.67（相當(dāng)于1 mL濃縮液含生藥材2.67 g）， 提取的生藥量為37.5%，4 ℃冷藏備用。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 SD大鼠雄性48只，體重 180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-（軍）2012-0004，所有大鼠均單代謝籠飼養(yǎng)，溫度 23～25 ℃， 相對(duì)濕度保持在55%～65%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。

適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為金鈴子散9.85，19.7，39.4 g·kg-1組（分別相當(dāng)于成人臨床給藥劑量的 5，10，20倍）和空白對(duì)照組，每組12只?？瞻讓?duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，浸膏用生理鹽水稀釋后灌胃給藥，給藥量分別為9.85，19.7，39.4 g·kg-1，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.4 樣品采集及處理 給藥2周后，每組取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1，ip）深度麻醉，下腔靜脈采集血液，于室溫下靜置 10 min，析出血清，251.5×g 離心10 min，取血清于 EP管中， 置于-80 ℃冰箱保存。各實(shí)驗(yàn)組中剩下的6只進(jìn)行恢復(fù)期間實(shí)驗(yàn)（不予灌藥，自由飲食飲水，觀察其體內(nèi)受金鈴子散毒性影響的恢復(fù)情況），期間不進(jìn)行給藥操作，自由飲食飲水，觀察大鼠對(duì)金鈴子散毒性的恢復(fù)情況，7 d后剖殺，收集血液，臟器（肝、腎）。大鼠尿液分別于第3天，第7天，第10天，第14天，第17天，第21天收集。收集的尿液于-80 ℃條件下低溫保存。取200 μL解凍后血清加入800 μL乙腈溶液沉淀蛋白，4 ℃ 251.5×g離心15 min，移取上清液供 LC-MS分析。

1.5 色譜質(zhì)譜條件 HP ODS C18 Hypersil色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為H2O（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，0～3 min，5%～10% B，3～8 min，10%～55% B，8～12 min，55%～65% B，12～15 min，65%～90% B，15～22 min，90%～10% B，22～28 min，10%～5% B，流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm。質(zhì)譜條件：采用正負(fù)離子MS2 Scan 模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L·min-1，霧化器壓力50 psi（1 psi=6.895 kPa），毛細(xì)管電壓（+）4 000 V，（-）3 500 V，掃描范圍m/z 50～1 000，掃描時(shí)間200 s，F(xiàn)ragmentor 135 V，采集速度2 Hz，Delta EMV （+） 200 V，（-） 250 V。

1.6 數(shù)據(jù)處理 將液質(zhì)聯(lián)用采集到的數(shù)據(jù)上傳至 XCMS 數(shù)據(jù)處理平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)譜特征離子評(píng)估。通過 XCMS分析結(jié)果對(duì)峰值保留時(shí)間偏差進(jìn)行質(zhì)控評(píng)價(jià)，手動(dòng)提取組間差別較大的化合物信息（P<0.05），并根據(jù)平臺(tái)生成的 PCA 結(jié)果，篩選多元統(tǒng)計(jì)分析中變異最大的化合物，通過匹配在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，鑒定并驗(yàn)證所得結(jié)果的正確性。將分析的數(shù)據(jù)上傳到 MetPA 數(shù)據(jù)處理中心，通過與 KEGG 數(shù)據(jù)匹配ID 后，尋找相關(guān)的代謝通路和相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。以 Fishers 正確性檢驗(yàn)和超幾何分布檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)在特定生物途徑中的隨機(jī)性進(jìn)行測試。另外部分差異性代謝物通過在相同液相條件下，比對(duì)三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀上的保留時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量來確認(rèn)。最后根據(jù)得到的 MetPA 預(yù)測數(shù)據(jù)，進(jìn)行代謝機(jī)制推斷和解釋。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行組間樣本方差分析（ANOVA），并結(jié)合方差分析中的 LSD 和 SNK 法對(duì)樣本組間差異情況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠尿液隨時(shí)間變化的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 取不同時(shí)間段金鈴子散39.4 g·kg-1劑量組大鼠尿液進(jìn)行液質(zhì)數(shù)據(jù)采集，將LC-MS分析的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

差異代謝物組篩選與鑒定提取中，將液質(zhì)聯(lián)用分析的正負(fù)離子數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)度化預(yù)處理數(shù)據(jù)后，以XCMS 建立2種離子模式數(shù)據(jù)的 PCA 模型，見圖1。正負(fù)離子模式下，主成分分析所得的前3個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率（R2）及累計(jì)貢獻(xiàn)率（Q2）分別為 0.610（0.871）， 0.720（0.952）。說明2種模式下的 PCA 模型有60%以上的變量可用于預(yù)測金鈴子散高劑量組毒性對(duì)不同劑量大鼠之間 87%以上的差異，模型預(yù)測能力良好。由圖可以看出隨著給藥次數(shù)的累積，大鼠尿液里的代謝物變化逐漸偏離0 d時(shí)的代謝物組群，且呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化。

2.2 液質(zhì)數(shù)據(jù)分析結(jié)果 為了減少組間差異，以隨機(jī)進(jìn)樣的方式，交替進(jìn)樣。將LC-MS采集到的數(shù)據(jù)，通過 XCMS 對(duì)數(shù)據(jù)自動(dòng)分析處理，XCMS 以 t 檢驗(yàn)對(duì)2組間平均豐度值進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，以P<0.05 提取差異變量。剔除加合、同位素及碎片離子。并根據(jù)相同色譜條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)化合物的液質(zhì)數(shù)據(jù)驗(yàn)證化合物的準(zhǔn)確性。結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的VIP的大小，大鼠血清和尿液最終在正負(fù)離子檢測模式共提取到44個(gè)差異性代謝物。

2.3 MetPA代謝途徑分析 將液質(zhì)聯(lián)用篩選出的44個(gè)代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetPA 進(jìn)行代謝通路查詢。相關(guān) 29條通路分析的詳細(xì)結(jié)果見表1，綜合 Raw p，Holm p，F(xiàn)DR，影響值結(jié)果，對(duì)與毒性相關(guān)代謝通路的重要性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果得到5個(gè)代謝通路：類固醇激素的生物合成，而戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換，賴氨酸代謝，谷胱甘肽代謝和抗壞血酸代謝因具有較大影響值（>0.3）也被列為潛在的代謝途徑，代謝通路分析見圖2。

3 討論

在本研究中，基于液質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)研究方法， 通過比較金鈴子散高、中、低劑量對(duì)大鼠代謝譜差異的影響，識(shí)別與毒性相關(guān)的代謝物通路，并進(jìn)行代謝通路分析，見圖3。由代謝網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，與毒性相關(guān)的代謝通路主要和生物體氨基酸代謝、能量轉(zhuǎn)換及激素代謝有關(guān)，這些代謝通路與肝臟線粒體功能相關(guān)性很大。

軛合反應(yīng)指藥物或其代謝物與生物機(jī)體的內(nèi)源性物質(zhì)相結(jié)合，產(chǎn)生極性更強(qiáng)的代謝物，更容易被排出體外，從而達(dá)到代謝的目的。葡萄糖醛酸軛合反應(yīng)負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)多種外源和內(nèi)源性化合物的清除，在多種藥物及其氧化代謝產(chǎn)物、體內(nèi)毒物、內(nèi)源性激素、膽酸的代謝清除中發(fā)揮著重要作用[4-8]。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶將葡萄糖醛酸（LC-MS正離子模式579.9）生成葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物，減少對(duì)目標(biāo)靶的親和性，增加了其在機(jī)體中的排泄，有更強(qiáng)的解毒和去活化作用[9-12]。金鈴子散中劑量組葡萄糖醛酸軛合反應(yīng)增加，排毒效果增加，而高劑量組含量相對(duì)較低，則說明肝腎受損，已不可逆轉(zhuǎn)。

抗壞血酸（ascorbic acid）是生物體內(nèi)重要的氧化還原劑，主要參與機(jī)體內(nèi)活性氧的清除和細(xì)胞調(diào)控， 并作為多個(gè)酶的輔因子參與多種生理過程[13-15]。抗壞血酸能使過氧離子失活，有較為廣泛的抗氧化損傷能力[16-17]。另外抗壞血酸與中性粒細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽相互作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，從而使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基減少。金鈴子散組中劑量組谷胱甘肽（LC-MS正離子模式304.1）含量較空白對(duì)照組下降，使得細(xì)胞抗氧自由基增加，使細(xì)胞損傷造成毒性。

類固醇是由機(jī)體內(nèi)分泌腺分泌的親脂性小分子化合物，一般作用于外周靶組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[18-19]。孕烯醇酮是所有類固醇激素的母體化合物，可以被氧化異構(gòu)化成孕酮并經(jīng)羥基化反應(yīng)生成其他類固醇激素。當(dāng)機(jī)體受到外界嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，下丘腦可產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，經(jīng)腺垂體產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素進(jìn)而合成和分泌糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇。皮質(zhì)醇通過對(duì)中間代謝，炎癥和免疫應(yīng)答的作用，使機(jī)體對(duì)應(yīng)激起反應(yīng)，嚴(yán)重者造成肝腎毒性損傷[20]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，金鈴子散組孕烯醇酮（LC-MS負(fù)離子模式329.1）含量升高，皮質(zhì)醇分泌代謝失衡，影響大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝。

谷胱甘肽是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）催化反應(yīng)中的底物， 在機(jī)體中可以有效清除機(jī)體內(nèi)的毒性物質(zhì)。還原型谷胱甘肽由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成，能氧化分解體內(nèi)的超氧因子，中和自由基對(duì)組織的損壞，防止因巰基氧化而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性，抑制細(xì)胞凋亡，降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而達(dá)到降低毒性的作用[21-23]。谷胱甘肽通過還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽互相轉(zhuǎn)化構(gòu)成生物體的氧化還原緩沖系統(tǒng)，與親電子基質(zhì)結(jié)合后可清除體內(nèi)的超氧離子和其他自由基[24-28]。另外，谷胱甘肽還可以通過谷氨酰胺循環(huán)途徑維持蛋氨酸的含量，以保證轉(zhuǎn)甲基及轉(zhuǎn)丙氨基反應(yīng)，促進(jìn)膽酸代謝，從而加快機(jī)體受損功能的恢復(fù)[29]。當(dāng)藥物對(duì)生物體的肝腎造成損害時(shí)，使自由基產(chǎn)生增多，導(dǎo)致谷胱甘肽生成不足，啟動(dòng)了谷胱甘肽極度缺乏的惡性循環(huán)，引起全身性功能的下降與損害如腦、肝和腎等臟器。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看金鈴子散39.4 g·kg-1劑量組谷胱甘肽（LC-MS正離子模式304.1）含量降低，19.7 g·kg-1劑量組谷胱甘肽含量上升，推測高劑量組體內(nèi)谷胱甘肽代謝調(diào)節(jié)已經(jīng)損壞，而低劑量組有一定的調(diào)節(jié)作用。

賴氨酸在生物體內(nèi)除了可以合成蛋白質(zhì)外，還可通過脫氨作用參與三羧酸循環(huán)，提供能量。賴氨酸為戊二酰輔酶A脫氫酶的代謝底物，當(dāng)戊二酰輔酶A脫氫酶不足時(shí)，產(chǎn)生賴氨酸代謝障礙，使四氫異喹啉在機(jī)體內(nèi)蓄積[30]。另外在賴氨酸的降解過程中，酵母氨酸途徑是其降解的主要通路[31-33]。與模型對(duì)照組相比金鈴子散高劑量組四氫異喹啉（LC-MS正離子模式190）含量升高，推測金鈴子散的毒性作用可能通過增強(qiáng)四氫異喹啉的代謝途徑，影響賴氨酸的代謝途徑，從而作用于線粒體的能量代謝或自由基的產(chǎn)生清除過程，導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡，造成機(jī)體損傷。

本課題采用傳統(tǒng)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與代謝組學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，對(duì)金鈴子散進(jìn)行毒性機(jī)制的探索。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，金鈴子散各劑量組大鼠對(duì)外界刺激反應(yīng)緩慢，金鈴子散高劑量組給藥后，不同時(shí)間段內(nèi)尿液代謝物表型的聚類分布明顯，且隨給藥時(shí)間的延長體內(nèi)代謝物質(zhì)的差異性逐漸增大，提示高劑量金鈴子散灌胃給藥后14 d，已經(jīng)干擾了大鼠體內(nèi)代謝物的組成，此時(shí)已存在潛在毒性。在代謝途徑方面，賴氨酸代謝和谷胱甘肽代謝對(duì)大鼠體內(nèi)毒性的影響最為顯著。從金鈴子散9.85，19.7， 39.4 g·kg-1組的亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，金鈴子散19.7，39.4 g·kg-1劑量組可造成明顯的肝腎毒性，9.85 g·kg-1劑量組毒性作用相對(duì)較弱。

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