馬曉麗+馬麗娜+毛新民+張雨潔+蘭怡

[摘要] 在確證自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）模型成功后比較其與正常大鼠（Wistar）尿液氨基酸代謝譜的差異， 在此基礎(chǔ)上初步研究兩色金雞菊提取物對SHR 血壓及氨基酸代謝譜的調(diào)節(jié)作用。選取經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后的適齡雄性SHR大鼠和同齡Wistar 大鼠測量大鼠收縮壓（SBP），舒張壓（DBP）， 同時收集大鼠尿液，運用AQC柱前衍生高效液相色譜（HPLC）-熒光法測定尿液中氨基酸代謝譜， 利用多元統(tǒng)計分析中的偏最小二乘方判別分析（PLS-DA）研究2組動物的氨基酸代謝差異物。將所有飼養(yǎng)的SHR大鼠隨機分成5組， 即模型組，兩色金雞菊提取物高、中、低劑量組（3.2，1.6，0.8 g·kg-1），西藥卡托普利組（4 mg·kg-1），連續(xù)灌胃給藥4周后收集大鼠尿液，測定各組氨基酸代謝譜。藥物干預4周后，與Wistar組相比， SHR組的氨基酸代謝譜中絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸對分組的貢獻較大，均顯著高于Wistar組；與SHR組相比，卡托普利組的蘇氨酸、蛋氨酸較模型組顯著降低（P<0.01）；新疆兩色金雞菊醇提物低、中、高劑量組氨基酸代謝均有不同程度改變，其中低劑量蘇氨酸較模型組顯著降低（P<0.01）；中劑量組的絲氨酸、蘇氨酸較模型組降低（P<0.05），纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸顯著降低（P<0.01）；大劑量組的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸顯著降低（P<0.01）。研究結(jié)果顯示，中、高劑量提取物能明顯改善氨基酸代謝異常，幫助進一步闡釋兩色金雞菊的藥性研究，為高血壓病存在氨基酸代謝通路異常提供數(shù)據(jù)支持。

[關(guān)鍵詞] 自發(fā)性高血壓大鼠； 氨基酸代謝譜； 高效液相； 兩色金雞菊

[Abstract] To compare the amino acid metabolic profiling in urine of spontaneously hypertensive rats （SHR） and normal Wistar rats， and investigate the regulatory effect of extract from Coreopsis tinctoria on blood pressure and amino acid metabolic profiling in SHR. Right aged SHR and Wistar rats were housed to fit the new environment for 2 weeks. After that， their systolic pressure（SBP）， diastolic pressure（DBP） were measured and urine was collected. Amino acids profiles for SHR and Wistar rats were acquired by using AQC precolumn derivatization HPLC-fluorescence method， and then partial least squares discriminant analysis（PLS-DA） was applied to facilitate differentiation and determine metabolic differences between collected samples from two groups of rats. Consequently， 40 SHR were randomly divided into 5 groups： model group， high， middle， low dosage groups of C. tinctoria extract （3.2， 1.6，0.8 g·kg-1）， and captopril group （4 mg·kg-1）. They were treated for 4 weeks by ig administration， and then their urine samples were collected to determine the amino acid metabolic profiling in various groups. After treatment for 4 weeks， as compared with Wistar group， serine， alanine， tyrosine， and cystine in the amino acid metabolic profiling were significantly increased in SHR group. As compared with SHR model group， threonine and methionine were decreased significantly in captopril group （P<0.01）； amino acid metabolism was changed to different degrees in high， middle， and low dosage groups of C. tinctoria extract， and the threonine in low dose group was significantly decreased （P<0.01）； serine and threonine were decreased （P<0.05）， and valine， methionine and lysine were significantly decreased （P<0.01） in middle dose group； threonine， valine， methionine and lysine were significantly decreased in large dose group （P<0.01）. The results showed that middle and high doses of extract from C. tinctoria could significantly improve disturbance of amino acid metabolism， help to further clarify the drug property research of C. tinctoria， and provide data support for amino acid metabolic pathway abnormalities in hypertension patients.

[Key words] spontaneously hypertensive rats（SHRs）； amino acid profiling； HPLC； Coreopsis tinctoria

高血壓是常見的心腦血管病，普遍認為它是不同原因和致病因素引起的復雜疾病，能誘發(fā)動脈粥樣硬化、中風等臨床表現(xiàn)，還可導致心、腦、腎等重要器官的損害[1]。自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）起初來自于血壓正常的Wistar Kyoto鼠交配，幼鼠出世后第5周開始出現(xiàn)嚴重高血壓并導致血管病變[2]。因其病程變化類似于人類原發(fā)性高血壓，因此非常適合于SHR的藥物干預實驗研究[3]。

兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.，又稱昆侖雪菊[4-5]，屬菊科植物，是中國的特有植物，新疆維吾爾自治區(qū)以野生兩色金雞菊代茶飲，具有降血壓、降血脂、降糖的功效[6-7]。有研究認為其效應(yīng)機制可能與降低氧化應(yīng)激，減少丙二醛（MDA），增加一氧化氮和減少血管緊張素（Ang-Ⅱ）有關(guān)[8-11]。 本課題組前期對自發(fā)性高血壓大鼠的代謝組學研究表

明，大鼠體內(nèi)部分氨基酸代謝產(chǎn)物和葡萄糖等能量代謝物質(zhì)明顯異于正常大鼠[12-14]。

本研究首次采用AQC柱前衍生高效液相色譜熒光法結(jié)合正交偏最小二乘法（PLS-DA），發(fā)現(xiàn)SHR與Wistar 2組氨基酸代謝譜存在明顯差異，通過定量方法找出了標志性氨基酸代謝物；模型確證后對兩色金雞菊各給藥組和卡托普利組的氨基酸代謝進行了綜合評價，探討金雞菊提取物長期給藥后高血壓大鼠尿液氨基酸的變化情況。

1 材料

無創(chuàng)血壓計（BP-98A，北京軟隆生物技術(shù)有限公司）；大容量低溫離心機（TDL-5M，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；低溫離心機（KDC-2046，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電子天平（中山市衡新電子有限公司）；分析天平（AB204-N，梅特勒-托勒德）；高效液相色譜儀，配有 2475熒光檢測器（美國Waters e2695）；快速混勻器（SK-1，江蘇金壇醫(yī)藥儀器廠）；溶劑過濾裝置、pH計（Sartorius，PB-10）；水浴鍋（DK-S22）；離心機（Multifuge X3R，Thermo）。

新疆兩色金雞菊醇提物按照專利工藝（專利號CN201210270799）進行提取并制備成凍干粉 （烏魯木齊三高和藥業(yè)有限公司提供）；卡托普利片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1211031）；氨基酸衍生試劑盒（AccQ·Fluor，美國Waters 公司），包括17種混合氨基酸對照品，2A和2B AQC粉末以及硼酸鹽緩沖液；Milli-Q超低有機物超純水機制備超純水（Millipore USA LLC production）；冰醋酸，無水乙酸鈉，甲醇和乙腈均為色譜純。

40只自發(fā)性高血壓大鼠（SHR，雄性，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），8只Wistar大鼠[雄性，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001]；飼養(yǎng)環(huán)境每天光照12 h，溫度為（21±2） ℃，濕度為45%～55%。

2 方法

2.1 SHR模型

將11周齡的40只雄性SHR大鼠和8只同齡Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，連續(xù)2 d測量大鼠血壓， 選取6只SHR大鼠作為模型組，8只Wistar大鼠為空白組，同時收集2組大鼠尿液。

2.2 分組及給藥

將40只SHR大鼠均衡隨機分為5組，即模型組、西藥卡托普利組（4 mg·kg-1）、兩色金雞菊醇提物低劑量組（0.8 g·kg-1）、中劑量組（1.6 g·kg-1）、高劑量組（3.2 g·kg-1），8只Wistar大鼠為空白組。大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，按10 mL·kg-1灌胃容積每天灌喂1次，連續(xù)灌胃給藥4周。

2.3 血壓測定

平均每5 d以無創(chuàng)血壓計測量1次血壓。操作時，將大鼠裝進保溫套中加熱5 min，連續(xù)測量5～6次，取其收縮壓（SBP）平均值作為該大鼠的血壓值。

2.4 尿液收集和處理

采用代謝籠收集造模成功后大鼠夜間12 h的尿液置于冰箱（-20 ℃）保存?zhèn)溆谩Ｌ幚砬皩⒛蛞河谑覝叵陆鈨鋈芙猓?2 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm濾膜將上清液過濾，移入EP管。吸取濾液10 μL放入高效液相進樣瓶中，分別加入AQC衍生試劑，渦旋1 min，水浴55 ℃，10 min后進行HPLC分析。

2.5 HPLC分析

采用Waters e2695操作系統(tǒng)；Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（大連伊力特）；流動相A：將稱取的無水乙酸鈉15.2 g加入1 850 mL水中溶解，用冰醋酸調(diào)pH為6.5，再加乙腈140 mL，流動相B：甲醇-乙腈-水20∶60∶20，梯度洗脫，0～5 min，0%～2% B，5～6 min，2%～6% B，6～15 min，6%～9% B，15～19 min，9%～21% B，19～32 min，21%～45% B，32～34 min，45%～55% B，34～38 min，55%～100% B，38～45 min，100%～0% B，流速1.0 mL·min-1；進樣量5 μL；柱溫37 ℃；熒光檢測，激發(fā)波長 235 nm，發(fā)射波長395 nm。用0.45 μm濾膜將充分混勻后的溶液進行過濾，采用熒光檢測器對尿液中游離氨基酸進行含量測定。

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線與定量下限 線性考察通過標準添加法。以添加的氨基酸峰面積為縱坐標，添加濃度為橫坐標進行線性回歸，各氨基酸峰面積和濃度的線性相關(guān)系數(shù)r為0.992 4～0.999 7。氨基酸的尿液定量限（LOQ）為0.001～0.087 mg·L-1。

2.6.2 方法的精密度、衍生穩(wěn)定性及回收率測定 連續(xù)進樣5次考察各氨基酸峰面積的精密度，各氨基酸峰面積的 RSD 均小于4.0%，滿足復雜生物樣品的氨基酸分析要求。衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性結(jié)果顯示通過AQC衍生后12 h內(nèi)氨基酸的峰面積RSD在5.0%以內(nèi)，說明衍生化后的樣品至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定?；厥章视商砑拥牡?、中、高3個濃度水平分別計算得到，本方法中氨基酸的回收率為85.40%～120.3%。

2.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果用±s來表示，組間比較采用方差分析。氨基酸代謝組的數(shù)據(jù)采用SIMCA-P 11軟件（Umetrics，Ume，Sweden）進行PLS-DA分析。

3 結(jié)果

3.1 SHR大鼠SBP的變化

實驗結(jié)果表明，SHR大鼠給藥各組血壓較模型組有明顯下降，參考本課題組已發(fā)表文章[14]。

3.2 SHR 和Wistar大鼠的尿液氨基酸代謝譜比較

采用AQC柱前衍生HPLC法測定生物樣本中游離氨基酸含量，結(jié)果見圖1，40 min內(nèi)各氨基酸對照品得到有效分離，衍生試劑峰對尿樣中氨基酸的測定基本沒有干擾，可以利用對照品對尿液中各氨基酸進行準確定量。將2組大鼠氨基酸代謝組學數(shù)據(jù)經(jīng)分析可得出一個滿意的模型，前2個主成分能解釋84.3%數(shù)據(jù)，見圖2。2組大鼠的數(shù)據(jù)集中分布于橢圓形散點圖（95%置信區(qū)域）的2個區(qū)域，說明高血壓大鼠在氨基酸代謝特征上與正常大鼠存在差異的變量化合物，見圖3，SHR的氨基酸代謝譜中絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸等氨基酸類代謝物對分組的貢獻較大，均顯著高于Wistar組。

3.3 兩色金雞菊對SHR大鼠尿液氨基酸代謝產(chǎn)物的影響

將兩色金雞菊各給藥組、卡托普利組與SHR 模型組大鼠的代謝數(shù)據(jù)經(jīng)PLS-DA 模型分析，得到一張散點圖，見圖4，各組數(shù)據(jù)基本聚集在一起， 可見組內(nèi)氨基酸代謝模式基本一致且具有各自聚類的趨勢， SHR模型組與陽性藥物卡托普利組以及兩色金雞菊給藥組存在一定的代謝差異。兩色金雞菊各給藥組中除了小劑量組分布較散亂外，中劑量到大劑量依次向正常組靠近，大劑量組最接近正常組的代謝模式，說明大劑量組對SHR大鼠體內(nèi)氨基酸的調(diào)節(jié)作用效果最好，甚至優(yōu)于陽性藥卡托普利組，提示兩色金雞菊組對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的調(diào)節(jié)作用可能還通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝紊亂來實現(xiàn)，可以使失衡的代謝譜由疾病狀態(tài)恢復到正常狀態(tài)。

3.4 SHR大鼠及各給藥組尿液氨基酸的含量變化

通過方差分析得出：與空白對照組相比，模型組大鼠尿液中絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸均顯著升高（P<0.01），灌胃給藥4周后，與模型組相比，卡托普利組的蘇氨酸、蛋氨酸

4 討論

本試驗對SHR這種最能模擬人類高血壓發(fā)生、發(fā)展過程的動物模型進行了氨基酸代謝譜測定分析。根據(jù)本組前期工作基礎(chǔ)，肯定了各給藥組對SHR大鼠血壓有著顯著降低作用的同時，應(yīng)用代謝組學技術(shù)中的靶標分析技術(shù)即氨基酸譜來研究高血壓大鼠氨基酸類代謝產(chǎn)物的變化，進一步闡釋藥物對高血壓大鼠的血壓調(diào)節(jié)作用及可能的多種作用機制。

實驗數(shù)據(jù)分別經(jīng)過多元統(tǒng)計分析處理和傳統(tǒng)的單因素方差分析，從代謝靶標分析結(jié)果看：兩色金雞菊各給藥組對SHR尿液氨基酸代謝具有一定調(diào)節(jié)作用，經(jīng)過PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)各給藥組與卡托普利組的代謝譜各自聚類，且較模型組有了明顯轉(zhuǎn)歸，體現(xiàn)了中藥的多組分、多靶點效應(yīng)，具有整體改善疾病內(nèi)環(huán)境的作用。而單因素方差分析結(jié)果同樣顯示金雞菊各給藥組對尿液中氨基酸的顯著改變，尤其中、高劑量組對多種氨基酸具有顯著降低作用，趨向正常水平，與多元分析結(jié)果基本一致，以此推斷氨基酸標志物作為后續(xù)研究的重點標點深入跟蹤分析。

綜上所述，本實驗結(jié)果可以從整體水平反映疾病治療過程中的氨基酸代謝變化，通過多元統(tǒng)計判別認為氨基酸代謝變化可與SHR大鼠在藥物作用下發(fā)生的血壓相關(guān)病理生理變化聯(lián)系起來，有助于更全面的闡述藥物的治療效果及分析作用機制。本研究通過高效液相色譜技術(shù)觀察SHR大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物變化，進一步了解到兩色金雞菊降低SHR大鼠血壓可能與氨基酸代謝有關(guān)。今后，還需要與蛋白組學等聯(lián)合分析才能深入了解兩色金雞菊對高血壓作用的詳細機制。

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