蔡艷+蔣偉+周愛玲+趙敏+徐玲

[摘要] 探討苦參素（oxymatrine，OMT）對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其機(jī)制。采用MTT法測(cè)定OMT對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響；生物化學(xué)法測(cè)定OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放率的影響；Hochest 33342染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡形態(tài)；實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元中Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表達(dá)；蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)海馬神經(jīng)元中p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)24 h，海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好；LPS刺激后，海馬神經(jīng)元LDH釋放率增加（P<0.01），JNK和p38的磷酸化水平明顯增加（P<0.01），Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達(dá)上調(diào)（P<0.01），海馬神經(jīng)元凋亡增加。OMT預(yù)處理后，能明顯降低海馬神經(jīng)元經(jīng)LPS刺激后的LDH釋放（P<0.05或P<0.01），減少p38和JNK磷酸化水平，降低Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達(dá)（P<0.01），海馬神經(jīng)元凋亡減少。綜上，OMT能降低經(jīng)LPS激活的p38和JNK磷酸化水平，下調(diào)Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3的表達(dá)，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡。OMT通過p38/JNK信號(hào)途徑抑制海馬神經(jīng)元的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 苦參素； 海馬神經(jīng)元； 細(xì)胞凋亡； p38/JNK

[Abstract] To investigate the effect and mechanism of oxymatrine（OMT） on hippocampal neurons apoptosis. Effect of OMT on survival of hippocampal neurons was measured by MTT.Effect of OMT on LPS-induced lactate dehydrogenase（LDH） release rate in hippocampal neurons was measured by biochemical methods. Hoechst 33342 staining was used to observe the apoptotic morphology of hippocampal neurons.The mRNA expression levels of Bax， Bcl-2， and Caspase-3 were detected by Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）， and the protein expression levels of p38， p-p38， JNK， p-JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blot.The results showed that， hippocampal neurons all grew well after treatment by different doses （0.37-6.0 g·L-1） of OMT for 24 h. Stimulation from LPS increased the release of LDH（P<0.01）， improved the JNK and p38 phosphorylation levels（P<0.01）， increased the proportion of Bax/Bcl-2 and the expression of Caspase-3（P<0.01）， and promoted the apoptosis of hippocampal neurons. OMT pretreatment could significantly reduce the release of LDH induced by LPS stimulation（P<0.05 or P<0.01）， reduce the p38 and JNK phosphorylation， decrease the expression of Caspase-3 and Bax/Bcl-2（P<0.01）， and diminish the apoptosis of hippocampal neurons.In conclusion， OMT could reduce the LPS-induced phosphorylation of p38 and JNK， down-regulate the Bax/Bcl-2 ratio and expression of Caspase-3， thus inhibiting apoptosis of hippocampal neurons. The mechanism may be associated with p38/JNK signaling pathway.

[Key words] oxymatrine； hippocampal neurons； apoptosis； p38/JNK

神經(jīng)退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）是一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，神經(jīng)細(xì)胞退行性病變是它們的共同特點(diǎn)。在大多數(shù)ND中，尤其是阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD） 特征性病理變化之一是腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，以海馬區(qū)和基底前腦受累最為嚴(yán)重，神經(jīng)元減少平均可達(dá)47%。近年來認(rèn)為細(xì)胞凋亡（apoptosis）是引起AD神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因[1-3]。

然而，目前尚無有效的藥物阻止或抑制AD腦組織中神經(jīng)元的凋亡?？鄥⑺兀╫xymatrine，OMT）是從苦參、苦豆子及廣豆根中分離提純出來的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶結(jié)構(gòu)，藥理和臨床試驗(yàn)證明，OMT可減少多種炎癥因子的活化，具有抗凋亡的藥理作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OMT 能明顯抑制由LPS誘導(dǎo)的大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元[5]。但對(duì)神經(jīng)退行性疾病如AD神經(jīng)元凋亡的影響及其機(jī)制未見報(bào)道。

本項(xiàng)目以非甾體抗炎藥阿司匹林（aspirin/acetylsalicylic acid，ASA）為陽(yáng)性藥對(duì)照[6]，應(yīng)用不同劑量的OMT分別預(yù)處理海馬神經(jīng)元，再用LPS刺激海馬神經(jīng)元，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）等方法探討OMT通過p38/JNK信號(hào)途徑對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其可能機(jī)制。通過上述研究，期望在理論上為OMT在抑制海馬神經(jīng)元凋亡作用方面提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 新生1 d的SD大鼠，SPF級(jí)，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（蘇）2012-0031。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning 公司，美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Jouan公司，法國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司）；各種型號(hào)的移液器（Eppendorf公司，德國(guó)）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；PTC-100 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Eppendorf核酸蛋白分析儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Elx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特儀器有限公司）；Mini protein-3電泳裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海華聯(lián)環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司恒溫儀器廠）；電熱恒溫水槽（上海華聯(lián)環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司恒溫儀器廠）；PB-10 pH計(jì)（北京塞多利斯公司）；TY-80S脫色搖床（南京新校園生物技術(shù)研究所）。

1.3 藥品與試劑 苦參素（寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司，批號(hào)F20110322），MTT（Fluka公司），LPS（Sigma，USA），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）（海門碧云天生物技術(shù)研究所，編號(hào)P0010S），十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20080521），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（MILLIPORE），預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（Fermentas，批號(hào)00067755），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（Fermentas，批號(hào)00066150），GENMED 乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒 （GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A，編號(hào)GMS10073v.A），兔抗Caspase-3多克隆抗體（rabbit anti-Caspase-3 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bax多克隆抗體（rabbit anti-Bax polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bcl-2多克隆抗體（rabbit anti-Bcl-2 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），鼠抗β-actin單克隆抗體（mouse anti-β-actin monoclonal antibody，Santa Cruz，編號(hào)sc-81178），JNK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，3496-1），JNK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，2155-1），p38 MAPK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1544-1），p38 MAPK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1229-1），Trizol reagent（Invitrogen），PCR引物由上海睿強(qiáng)生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成（表1）。

2 方法

2.1 OMT對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)7 d左右，分為正常對(duì)照組和不同質(zhì)量濃度的OMT（0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）[7]組。吸去各組的培養(yǎng)基，不同濃度的OMT組：為含有相應(yīng)濃度OMT的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組換為等體積的培養(yǎng)基，孵育24 h，用MTT法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元的存活率。

實(shí)驗(yàn)步驟：吸去96孔板的細(xì)胞原培養(yǎng)液，每個(gè)孔加入25 μL MTT，37 ℃孵育4 h后棄去上清液，每孔加入100 μL 20%SDS溶液，37 ℃孵育24 h，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以正常對(duì)照組的細(xì)胞活力為100%，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活百分率。細(xì)胞存活率=（給藥組的細(xì)胞活力÷正常對(duì)照組的細(xì)胞活力）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.2 不同濃度OMT預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元LDH釋放率的影響 把海馬神經(jīng)元接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d左右，分為正常對(duì)照組和不同濃度的OMT（0，0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）預(yù)處理組。不同濃度的OMT預(yù)處理組：根據(jù)前期研究結(jié)果及參考文獻(xiàn)方法[7-8]，采用含有相應(yīng)濃度OMT的培養(yǎng)基孵育3 h后，再加入終質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的 LPS作用24 h，正常對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒測(cè)定各組海馬神經(jīng)元的LDH的釋放量。具體步驟參考LDH試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.3 Hochest 33342染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡形態(tài) 實(shí)驗(yàn)分組：①正常對(duì)照組（僅加入培養(yǎng)基）；②LPS組（10 mg·L-1）；③ASA（5.0 mmol·L-1）[9]+LPS（10 mg·L-1）組（陽(yáng)性藥對(duì)照組）；④OMT中劑量（1.5 g·L-1）+LPS（10 mg·L-1）組。具體步驟如下：于玻片上將培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)細(xì)胞，采用OMT預(yù)處理3 h 后，加入終濃度為10 mg·L-1的LPS，作用24 h。取出玻片進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，進(jìn)行沖洗。4%多聚甲醛4 ℃固定。10%山羊血清室溫封閉1 h棄血清，再次沖洗。Hoechst 33342（1∶1 000稀釋）室溫15 min，ddH2O沖洗。用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，進(jìn)行凋亡核計(jì)數(shù)并隨機(jī)拍照。

2.4 RT-qPCR法檢測(cè)OMT預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表達(dá)變化 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)分成7組：①正常對(duì)照組（Normal組，僅加入培養(yǎng)基）；②脂多糖組（LPS組，10 mg·L-1）；③阿司匹林+脂多糖組（ASA+LPS組，5.0 mmol·L-1+10 mg·L-1）；④苦參素組（OMT，1.5 g·L-1）；⑤苦參素低劑量+脂多糖組（OMT-L+LPS組，0.75 g·L-1+10 mg·L-1）；⑥苦參素中劑量+脂多糖組（OMT-M+LPS組，1.5 g·L-1+10 mg·L-1）；⑦苦參素高劑量+脂多糖組（OMT-H+LPS組，3.0 g·L-1+10 mg·L-1），提取細(xì)胞總RNA用于Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA測(cè)定。按照文獻(xiàn)方法操作[10]。

2.5 Western blot 法檢測(cè)OMT預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)變化 取原代培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分組同RT-qPCR法，蛋白質(zhì)濃度用BCA法檢測(cè)，蛋白印跡結(jié)果重復(fù)3次，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，GraphPad Prism 5軟件分析統(tǒng)計(jì)各組特異性蛋白質(zhì)表達(dá)量（均以β-actin為內(nèi)參）。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和兩兩比較，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 OMT對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，按公式計(jì)算出各組細(xì)胞存活率。結(jié)果可見，與對(duì)照組相比，不同濃度的OMT各給藥組之間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示不同濃度的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)24 h，海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)比較好。

3.2 不同濃度OMT預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元LDH釋放率的影響 觀察不同濃度的OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的毒性（LDH釋放率）作用。結(jié)果可見，與對(duì)照組相比，LPS組的海馬神經(jīng)元的LDH釋放率明顯增大（P<0.01）。與LPS組相比，不同濃度的OMT能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的LDH釋放率（P<0.05或P<0.01），且在一定濃度范圍內(nèi)隨著OMT濃度的增大，降低LDH釋放率的作用呈增大趨勢(shì)。但OMT在低質(zhì)量濃度0.37 g·L-1減少LPS誘導(dǎo)LDH釋放率相對(duì)較弱，而OMT在3.0，6.0 g·L-1時(shí)LDH釋放率沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇OMT為0.75，1.5，3.0 g·L-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

3.3 Hochest 33342 染色觀察各組海馬神經(jīng)元凋亡形態(tài) 各組海馬神經(jīng)元Hoechst 33342染色，結(jié)果顯示正常的海馬神經(jīng)元核為圓形或者卵圓型，染色均勻。而一部分神經(jīng)元核呈凹陷狀或碎塊狀，染色不均或者濃染，可能為凋亡細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，LPS組凋亡細(xì)胞相對(duì)較多。與LPS組相比，ASA+LPS組和OMT+LPS組凋亡細(xì)胞顯著減少，見圖2。

3.4 Western blot法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元p-38及p-p38蛋白的表達(dá) 對(duì)照組海馬神經(jīng)元中p38磷酸化蛋白表達(dá)相對(duì)較少。與對(duì)照組相比，LPS組p38磷酸化蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的p38磷酸化蛋白表達(dá)的增高（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組能減弱LPS誘導(dǎo)的p38磷酸化蛋白表達(dá)的作用，且在一定的劑量范圍內(nèi)隨OMT的劑量增大，作用增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01），見圖3。

3.5 Western blot法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元JNK及p-JNK蛋白的表達(dá) 對(duì)照組海馬神經(jīng)元中JNK磷酸化蛋白表達(dá)相對(duì)較少。與對(duì)照組相比，LPS組JNK磷酸化蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）；OMT組與對(duì)照組相比，JNK磷酸化蛋白表達(dá)沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與LPS組相比，ASA+LPS組JNK磷酸化蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的JNK磷酸化蛋白表達(dá)的增高（P<0.05或P<0.01），且在一定劑量范圍內(nèi)隨著OMT劑量增大，JNK磷酸化蛋白的表達(dá)逐漸減少，見圖4

3.6 RT-qPCR檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元中Bax，Bcl-2mRNA的表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例明顯增高（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例明顯降低（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例顯著低于LPS組（P<0.01），見圖5。

OMT+LPS組在一定的劑量范圍內(nèi)隨OMT劑量的增大，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖7。

3.7 RT-qPCR檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元中Caspase-3 mRNA的表達(dá)變化 對(duì)照組海馬神經(jīng)元中Caspase-3 mRNA的表達(dá)相對(duì)較少。與對(duì)照組相比，LPS組Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增多（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的Caspase-3 mRNA的表達(dá)增多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組在一定劑量范圍內(nèi)隨著OMT劑量的增大，其降低LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中Caspase-3 mRNA表達(dá)增多的效果也逐漸增強(qiáng)。（P<0.05或 P<0.01），見圖6。

3.8 Western blot法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元中Bax，Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達(dá) 對(duì)照組中，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達(dá)比較少。與對(duì)照組相比，LPS組Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）；OMT組Bax/Bcl-2比例和 Caspase-3蛋白的表達(dá)沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯下調(diào)Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達(dá)（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組在一定的劑量范圍內(nèi)隨OMT劑量的增大，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖7。

4 討論

阿爾茨海默?。ˋD）、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森綜合征（Parkinson′s syndrome，PD）等神經(jīng)退行性疾病，在海馬區(qū)和基底前腦等腦組織的神經(jīng)元發(fā)生了凋亡。但目前尚無有效藥物阻抑神經(jīng)元的凋亡。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏等藥理作用[11] ，可抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），降低多種炎癥因子的活化，具有抗凋亡的藥理作用。

然而，OMT對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。

4.1 OMT能降低海馬神經(jīng)元LDH 釋放率抑制細(xì)胞凋亡 OMT預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元LDH釋放率結(jié)果顯示，LPS對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞膜有毒性作用，OMT在適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷥?nèi)，能明顯減少LPS誘導(dǎo)的LDH釋放率，對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞膜有保護(hù)作用。Hochest染色法結(jié)果可見，LPS刺激后對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用引起了細(xì)胞凋亡；OMT預(yù)處理可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。

4.2 OMT能降低LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元JNK和p38磷酸化水平 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。MAPK的作用是將信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的十分重要傳遞者。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要有，p38通路、c-Jim氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK） 通路。p38已經(jīng)被證實(shí)在PC12和小腦顆粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控的過程中有著非常重要的作用，而且p38在被胰島素預(yù)處理過培養(yǎng)的新生神經(jīng)細(xì)胞中將會(huì)失活[12-13]。p38被磷酸化，表明了p38激活。JNK途徑的激活參與了不同刺激所致凋亡的啟動(dòng)。JNK激活不僅參與了藥物誘導(dǎo)的凋亡，而且參與了一些DNA損傷刺激引起的凋亡[14]。JNK的磷酸化產(chǎn)物p-JNK標(biāo)志著JNK激活。ERK 信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中具有雙重作用，即既有抗凋亡作用，也有促進(jìn)凋亡作用，因其作用的復(fù)雜性，故本實(shí)驗(yàn)采用了LPS剌激海馬神經(jīng)元，Western blot檢測(cè)p38，JNK及其磷酸化蛋白的表達(dá)變化。LPS能明顯上調(diào)p38和JNK磷酸化蛋白的表達(dá)，p38和JNK被激活，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡。各劑量OMT預(yù)處理能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元JNK和p38磷酸化水平，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡。OMT抑制LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡與降低p-JNK，p-p38有關(guān)。

4.3 OMT預(yù)處理能降低海馬神經(jīng)元Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達(dá) OMT能降低p-JNK與p-p38的表達(dá)，然后又通過何種機(jī)制抑制LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡？近年來研究發(fā)現(xiàn)，JNK能介導(dǎo)多種細(xì)胞外刺激引起細(xì)胞凋亡，參與了多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。活化后的JNK有一部分存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可以通過磷酸化作用直接調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員（Bim，Bax，Bcl-2等）的活性，從而誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[16] 。在Bcl-2家族成員中，Bax在線粒體細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著主要作用?；罨腏NK一方面能夠磷酸化激活Bax，Bim等，同時(shí)又可以抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白?；罨腂ax移位至線粒體外膜，使線粒體膜通透性增高釋放Cyt C，Smac/DIABLO及凋亡誘導(dǎo)因子等促進(jìn)凋亡的線粒體蛋白[17]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt C與凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）等結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，從而誘導(dǎo)Caspase依賴的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。激活后的p38能夠活化Caspase-3， 啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，活化的Caspase-3又進(jìn)一步切割不同的底物，使蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)不斷放大，促使細(xì)胞凋亡。Liu等研究發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38還能夠上調(diào)Fas/FasL，引起Caspase-3活化，認(rèn)為p38在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了雙重作用，但細(xì)胞的凋亡最終都是通過活化Caspase-3完成的[18]。

Bcl-2基因家族包括兩大類：一類是凋亡抑制基因：Bcl-2，Bcl-x1等；另一類是促凋亡基因：Bax，Bak等，Bax蛋白具有對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用，Bax與Bcl-2在體內(nèi)通過結(jié)合形成二聚體而發(fā)揮作用。當(dāng)Bax與Bcl-2表達(dá)相平衡時(shí)，細(xì)胞的存活期正常；當(dāng)Bcl-2高表達(dá)，而Bax的表達(dá)未相應(yīng)增多時(shí)，Bax與Bcl-2形成異型二聚體發(fā)揮作用，抑制凋亡的發(fā)生，細(xì)胞的存活期延長(zhǎng)；當(dāng)Bax高表達(dá)，而Bcl-2形成同型二聚體，啟動(dòng)Caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2比值的變化較單一的Bax或者Bcl-2的表達(dá)更可靠和敏感，更可以作為檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的指標(biāo)之一。

綜上所述，LPS通過上調(diào)海馬神經(jīng)元p38和JNK磷酸化蛋白水平，p38和JNK被激活，使Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3表達(dá)增加，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡。各劑量OMT預(yù)處理能夠明顯降低LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元JNK和p38磷酸化水平，使Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3表達(dá)減少，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡。

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