蔣旗 黃贊松　蘇建偉　曹聰

【摘要】 目的：觀察苦參素（OM）對人肝癌細胞株HepG2細胞增殖、細胞內(nèi)ATP含量、上清液乳酸生成速率的影響，探討其可能的機制。方法：體外培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2，CCK-8法觀察不同濃度、不同作用時間的OM對HepG2細胞增殖的影響；高效液相色譜技術、乳酸試劑盒分別檢測苦參素作用48 h后細胞內(nèi)ATP、上清液乳酸乳酸生成速率影響。結果：OM可以抑制人肝癌細胞株HepG2細胞增殖，其作用效果隨藥物濃度、作用時間增加而增強（P<0.05）；不同濃度苦參素作用48 h后細胞內(nèi)ATP含量、上清液乳酸生成速率顯著下降（P<0.05）。結論：OM可以抑制人肝癌細胞株HepG2細胞增殖，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性，作用機制可能是抑制細胞有氧糖酵解使細胞內(nèi)ATP含量下降有關。

【關鍵詞】 肝癌細胞株HepG2； 苦參素； 三磷酸腺苷； 糖酵解

Influence of Oxymatrine on Proliferation and Energy Metabolise of HepG2 Hepatoma Cell/JIANG Qi，HUANG Zansong，SU Jianwei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（13）：027-030

【Abstract】 Objective：To observe the effects of oxymatrine（OM） on the proliferation、The level of intracellular ATP and Lactic acid concentration in the culture supernatant of HepG2 hepatoma cell，and to disscuss potential mechanism.Method：HepG2 hepatoma cell was cultured in vitro，CCK-8 method was used to detect the proliferation effect at the different concentrations and different times；a high performance liquid chromatography and enzymatic colorimetric method were used to measure the levels of intracellular ATP and the rate of lactic acid concentration growth in the culture supernatant after treating with 48 h oxymatrine respectively.Result：There was significant difference in inhibited effect of OM on the proliferation of HepG2 hepatoma cell，and with the increase of OM concentration and prolonging the time of action， the inhibition effect of OM on the human hepatoma cell line HepG2 was more obvious（P<0.05）.The level of intracellular ATP lower and the rate of Lactic acid concentration growth in the culture supernatant After treating with 48 h OM by the different concentrations（P<0.05）.Conclusion：OM can inhibit the proliferation of HepG2 hepatoma cell，and there is time and dose depended.The mechanism of OM anti-hepatoma may be that through targeting of the glycolytic pathway and results in decreased ATP.

【Key words】 HepG2 hepatoma cell； Oxymatrine； Adenosine triphosphate； Glycolysis

First-authors address：Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.007

有氧糖酵解即“Warburg effect”參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移成為研究的熱點，基于腫瘤細胞能量代謝為靶點的藥物，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新的突破口[1-3]。前期實驗研究表明苦參素可能通過上調(diào)MicoRNA122[4]，從而抑制肝癌HepG2細胞增殖。近來研究發(fā)現(xiàn)MircoRNA是關鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，直接或間接參與癌癥的代謝。因此研究苦參素對HepG2細胞能量代謝影響，進一步研究其抗腫瘤作用。目前研究苦參素影響腫瘤細胞能量較少。本實驗研究苦參素（Oxymatrine或OM）對HepG2細胞增殖及細胞內(nèi)ATP含量影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2人肝癌細胞株：購于中科院上海細胞庫；DMEM無糖培養(yǎng)基（GFM）、DMEM低糖培養(yǎng)基（GM）：購于美國GIBICO；胰酶-EDTA混合液、RPMI-1640培養(yǎng)液：購于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒：購于碧云天生物科技；苦參素注射液：購于正大天晴藥業(yè)股份有限公司；三磷酸腺苷（ATP）購于美國Sigma公司，HPLC級；抗霉素-A（AntA）美國Sigma公司。儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱MCO-18AIC、戴安U3000型液相色譜儀、雷磁PHS-3C PH計、乳酸測定試劑盒

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測OM作用HepG2細胞增殖的影響 分組：實驗組（OM組）、陰性與空白對照組；取細胞懸液高倍細微鏡計數(shù)細胞密度，將細胞密度為5 000個細胞/mL接種到96孔中，100 μL/孔。恒溫培育至細胞貼壁，加入事先配置苦參素培養(yǎng)液，使其最終濃度為由0.5 mg/mL逐倍增加至8 mg/mL，每個濃度做5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，10 μL/孔，繼續(xù)培育4 h，置于酶標儀上測定450 nm處的吸光度。計算腫瘤細胞抑制率。

1.2.2 HPLC法研究OM對HepG2細胞能量代謝的影響 流動相：甲醇（99︰1）︰100 mmol/l磷酸鹽緩沖液，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL，流速：0.6 mL/min，檢測波長：254 nm。色譜柱：C18色譜柱（4.6×250 mm，粒徑5 μm）。使用ATP標準品得出色譜圖，同時應用回歸方程建立標準曲線。

1.2.2.1 細胞培養(yǎng) 分組：實驗組（1.0 mg/mL OM）及陰性對照組（加培養(yǎng)基）；取對數(shù)生長期細胞1瓶進行細胞計數(shù)，接種到4孔板中，每孔加入細胞密度1×106/mL。培育細胞貼壁進行實驗。

1.2.2.2 細胞上清液乳酸含量測定：加入不含血清的GFM、GM進行培養(yǎng)，每孔3 mL，每8小時抽取100 μL上清液測定。同時實驗組在24 h分別加入或不加入2 μg/mL AntA后每8小時抽取500 μL上清液測定。

1.2.2.3 細胞內(nèi)ATP含量測定 用PBS水重懸1 mL，取1×105個細胞進行檢測，1 500 rpm離心5 min，重懸于0.5 mL預冷的純凈水，按純凈水與6%三氯乙酸體積1︰1沉淀蛋白，渦旋、離心，條件為（4 ℃低溫、130 000 r/min、10 min）。HPLC測定細胞內(nèi)ATP含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察OM對HepG2細胞生長的影響 將HepG2細胞接種到96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入OM，每24小時觀察一次，發(fā)現(xiàn)OM對HepG2細胞的抑制作用隨作用時間、藥物濃度增加而更加顯著，見圖1、2。

2.2 CCK-8法測定不同濃度OM作用HepG2細胞48、72 h增殖抑制的影響 實驗表明OM對肝癌細胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間延長顯著增加（P<0.05或者<0.01），見表1。

2.3 乳酸含量測定 HepG2細胞經(jīng)1.0 mg/mL IC50OM作用后GM培養(yǎng)基中乳酸增長的速率下降了3倍，GFM下降1.5倍；HepG2細胞經(jīng)抗霉素A作用后GM培養(yǎng)基中乳酸增長的速率增加1.7倍，GFM增加5倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.4 細胞內(nèi)ATP含量測定 經(jīng)不同濃度苦參作用HepG2細胞48 h后各實驗組細胞內(nèi)ATP含量低于對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

肝癌發(fā)病率位居于全球第六位[5]。每年有超600 000例被診斷出肝癌，同時其死亡人數(shù)與其相當[6]。超過四分之三的患者發(fā)生在東亞，其中我國約占50%[7]。目前原發(fā)性肝癌的治療手段主要為手術。但約80%肝癌患者在診斷出已屬于中晚期同時合并有肝硬化失代償期，失去手術機會[8]。因此目前肝癌的治療仍缺乏有效的手段，常以手術輔助放、化療等綜合治療為主，但化療毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥，中藥抗腫瘤毒副作用少且有效，同時增強機體免疫力而受到重視。

苦參素又名氧化苦參堿，多項實驗證明苦參素有抗癌作用[9-10]，但目前作用機制仍未能完全闡述。近來研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA是關鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，能對腫瘤細胞糖、脂肪、氨基酸代謝的關鍵分子加以調(diào)控，從而直接或間接參與癌癥的代謝[11]。MicroRNA122是肝臟含量最豐富的miRNA，占肝臟miRNA70%，但在肝癌細胞組織中明顯下調(diào)[12]。多項研究表明MicroRNA122與肝癌的發(fā)生發(fā)展關系密切[13]。研究表明其能降低肝癌細胞活力、促進癌細胞凋亡。同時筆者前期實驗表明苦參素可使肝癌細胞內(nèi)MicroRNA122上調(diào)[4，14]，而MicroRNA122在肝臟代謝中發(fā)揮著重要的作用。丙酮酸激酶（ pyrurate kinase，PK）有兩種亞型M1、M2，PKM2在HCC細胞有氧糖酵解中起重要作用，為肝癌的生長增殖提供保障[15]，而Liu等[16]發(fā)現(xiàn)MircoRNA122與PKM2成反比，因此，上調(diào)HHC中的MircoRNA122有可能抑制HHC有氧糖酵解。目前關于苦參素對肝癌細胞能量代謝研究的實驗報道較少。

王淑靜等[9]研究OM對人胃癌細胞SGC7901及人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304細胞增殖抑制作用，得出當藥物濃度達0.4 mg/mL時對兩種細胞具有明顯抑制作用，且具有時間-濃度依賴性。本研究采用CCK-8法發(fā)現(xiàn)藥物濃度達1 mg/mL以上抑制HepG2細胞增殖，同時隨時間、藥物濃度增加抗腫瘤作用增加，與王淑靜等[9]研究結果一致。

腫瘤細胞通過改變新陳代謝基因編碼使其利于生長、生存及增殖，這種代謝改變的共同特點：依賴糖酵解供能，促進葡萄糖的攝取、使葡萄糖發(fā)酵為乳酸。這種現(xiàn)象被稱Warburg效應。為什么腫瘤細胞選擇低產(chǎn)能的有氧糖酵解方式一直是科學家的謎團，盡管有氧糖酵解產(chǎn)能效率低下，但腫瘤組織通過有氧糖酵解的葡萄糖代謝速率更高，這種代謝途徑使得葡萄糖產(chǎn)生乳酸的速率較氧化磷酸化快10～100倍[17]。同時有氧糖酵解過程中產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物如：NADH、NADPH，可以作為細胞增殖的重要原料。在肝癌組織可以利用有氧糖酵解產(chǎn)生的ATP及和中間產(chǎn)物，供其快速生長[18]。同時大量乳酸生成，導致酸性微環(huán)境，有利于肝癌細胞生存[19]。因此，基于腫瘤細胞能量代謝為靶點的藥物，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新的突破口。近來研究發(fā)現(xiàn)MircoRNA是關鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，直接或間接參與癌癥的代謝。MicoRNA122在肝臟的能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用，筆者前期實驗發(fā)現(xiàn)OM能上調(diào)HepG2細胞MicoRNA122基因[4]，因此使得OM能調(diào)節(jié)HepG2能量代謝成為可能。

胡修明[20]實驗表明苦參素抑制K562腫瘤細胞增殖的機制可能抑制細胞內(nèi)丙酮酸激酶活性從而阻斷糖酵解途徑。筆者研究中發(fā)現(xiàn)HepG2細胞經(jīng)1.0 mg/mL OM作用后乳酸增長的速率在GM下降了3倍、GFM下降1.5倍（P<0.05），提示苦參素可以抑制糖酵解，使細胞培養(yǎng)上清液乳酸生成速率下降。同時HepG2細胞經(jīng)過不同濃度OM作用48 h后，相比陰性對照組，細胞內(nèi)ATP含量呈現(xiàn)下降趨勢，與前者實驗相吻合[20]。同時細胞內(nèi)ATP含量隨OM濃度增加而逐漸下降，與文獻[21]報道抑制腫瘤細胞ATP合成可抑制細胞增殖一致。本次研究發(fā)現(xiàn)OM抑制HepG2細胞增殖與影響腫瘤細胞能量代謝有關，表明OM抗腫瘤作用藥理機制可能通過影響HepG2細胞有氧糖酵解。

作為實驗性研究，本實驗仍有較多需進一步完善地方如：沒有檢測OM對有氧糖酵解關鍵酶如丙酮酸激酶活性影響；沒有進一步研究OM作用HepG2細胞后影響MircoRNA122表達與有氧糖酵解的關系。綜上所述，OM能抑制HepG2細胞增殖，其可能的機制是抑制細胞有氧糖酵解使細胞內(nèi)ATP含量下降有關。

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（收稿日期：2018-03-13） （本文編輯：周亞杰）